实验材料选自四川农业大学校园绿化带内栽培的金心吊兰及其野生型全绿吊兰, 分别于2012年5月10日采集后, 去掉泥土和腐烂的老叶, 栽培于灭菌后的石英砂上, 置于人工气候箱中(20℃, 12 h光照/12 h黑暗, 相对湿度60%), 定时浇灌完全Hoagland培养液。生长至6月25日, 选取长势一致的苗株各12株, 分别给予10%, 20%, 30%浓度的PEG-6000处理, 以不加PEG-6000为对照。处理0, 2, 4, 6 d后, 采集其从顶端往下第4片成熟叶中段测定生理指标, 各处理取样3次重复, 指标测定时各样品重复测定3次。

叶绿素原位荧光检测, 分别采集金心吊兰及其野生型全绿吊兰叶片的边缘和中心部分做冰冻切片, 然后将切片放于Olympus DP71荧光显微镜下, 观察并照相(FITC, EX465-495, DM505, BA515-555)。叶绿素和类胡萝卜素的含量测定参考袁明等^[10]的方法。丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法^[11]。过氧化氢(H₂O₂)含量与超氧阴离子( O2-·)含量测定参考李忠光和龚明^[12]的方法。SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)还原法, 以还原50% NBT为1个酶活单位^[13]。POD活性的测定采用愈创木酚法^[14]。

用隶属函数法^[15]对金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘与中心部分的抗旱性进行综合评价。用下式计算每个样品各项指标的具体隶属函数值:Xu=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin), 式中, X 为参试样品某一抗旱指标的测定值, Xmax, Xmin分别为所有试样中该指标的最大值和最小值, 若某一指标与抗旱性呈负相关, 可通过反隶属函数计算其隶属函数值, 公式为:Xu=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin), 最后把每个试样各项指标隶属函数值累加, 取其平均值, 根据各样品平均隶属函数值大小确定其抗旱性强弱。平均值越大, 抗旱性越强, 反之, 抗旱性越弱。

所得数据均用Excel 2007和SPSS 19进行处理分析, 并使用t-检验对样本间差异性进行显著性检测, 图中数据为平均值± 标准误差。

叶片经冰冻切片后, 将切片置于Olympus DP71荧光显微镜下检测叶片横截面的叶绿素原位荧光, 如图1所示, 金心吊蓝绿色部分与野生型全绿吊兰边缘部分的叶绿体数量, 分别多于金心吊兰黄白色部分和野生型全绿吊兰中心部分。在金心吊兰的黄白色部分(图1A)未检测到叶绿素的荧光, 说明叶绿素含量极低, 无典型的叶绿体。野生型全绿吊兰的边缘部分的叶绿体数量明显多于中心部分(图1 A)。

从叶绿素含量的定量分析(图1B)显示, 全绿吊兰的边缘部分叶绿素含量为其中心部分的1.9倍, 其中叶绿素a为中心部分的2.1倍, 叶绿素b的分布无明显的位置效应。对金心吊兰而言, 其边缘部分总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b含量分别为中心的91.5, 98.3和77.1倍, 扣除吊兰叶绿素分布的位置效应, 金心吊兰中心部分的叶绿素积累明显受到抑制。金心吊兰边缘部分的叶绿素含量略高于野生型。

图1

Fig.1

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图1 叶绿素原位荧光检测及叶绿素含量LB:金心吊兰绿色部分; LC:金心吊兰黄白色部分; LBW:野生型全绿吊兰边缘部分; LCW:野生型全绿吊兰中心部分。A:叶绿素原位荧光; B:叶绿素含量。下同。Fig.1 Auto-fluorescent of chlorophylls in different parts of leaves and their contentsLB: Leaf blade part of C. capense var. medio-pictum; LC: Leaf center part of C. capense var. medio-pictum; LBW: Leaf blade part of C. capense; LCW: Leaf center part of C. capense. A: Auto-fluorescent of chlorophylls; B: Contents of chlorophylls. The same below.

在植物体内的H₂O₂主要产生于线粒体、叶绿体和过氧化物酶体中, 线粒体中约1%5%氧被用于产生H₂O₂^[7], 随着PEG-6000胁迫浓度的增加, 金心吊兰和野生型全绿吊兰的H₂O₂含量也逐渐增加, 且随着胁迫时间的增加, H₂O₂含量随之而上升(图2)。金心吊兰和野生型全绿吊兰的边缘部分H₂O₂含量总是高于各自的中心部分, 都在第6天达到最高含量。在30%浓度胁迫下, 随着胁迫时间的延长, 野生型全绿吊兰边缘部分H₂O₂含量增幅最大, 达到90.2%。而金心吊兰黄白色部分变化幅度较小, 仅发生小幅变化。

图2

Fig.2

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	图2 干旱胁迫下叶片不同部分H2O2含量的影响Fig.2 Effects of drought stress on the H2O2 content in different parts of leaves

随着胁迫时间的增加, 在不同浓度PEG-6000胁迫下, 金心吊兰边缘的绿色部分和黄白色部分的 O2-·含量都出现上升的趋势, 并都在第6天达到最大值(图3), 它们分别是各自胁迫处理前 O2-·含量的18.5, 19.7, 20.8倍和2.3, 3.3, 4.2倍。在10%, 20%和30%浓度下, 金心吊兰边缘部分的 O2-·含量都显著高于其中心部分(P< 0.05)。金心吊兰边缘部分和黄白色部分在30%浓度胁迫下, O2-·含量增幅最大, 分别达到95.2%和76.1%。野生型全绿吊兰边缘部分和中心部分在30%浓度胁迫下, O2-·含量增幅分别为79.7%和72.7%。

图3

Fig.3

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	图3 干旱胁迫对叶片不同部分 O2-·含量的影响Fig.3 Effects of drought stress on the O2-· content in different parts of leaves

10%, 20%和30%浓度PEG-6000处理后, 金心吊兰和野生型全绿吊兰叶片中的MDA含量随着浓度的增加而一直上升。随着胁迫天数的增加, 金心吊兰和野生型全绿吊兰叶片中的MDA含量一直上升, 并在第6天达到最大值(图4), 金心吊兰的边缘与中心部分分别为各自胁迫处理前实验组的3.7, 5.0, 6.2倍和2.9, 3.2, 7.2倍, 野生型全绿吊兰的边缘与中心部分分别为各自胁迫处理前实验组的4.7, 5.3, 6.8倍和5.8, 6.7, 7.8倍。从图中可以看出边缘部分显著高于中心部分的MDA含量(P< 0.05), 表明边缘部分的膜脂过氧化程度更强, 受到的破坏更严重。

图4

Fig.4

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	图4 干旱胁迫对叶片不同部分MDA含量的影响Fig.4 Effects of drought stress on the MDA content in different parts of leaves

不同浓度PEG-6000胁迫后, SOD活性曲线显示(图5), 随着胁迫时间的增加, 金心吊兰与野生型全绿吊兰的SOD活性都出现了先上升后下降的趋势, 在第4天达到最大值。金心吊兰和野生型全绿吊兰的边缘部分的SOD活性高于中心部分(P< 0.05)。金心吊兰边缘部分在10%, 20%和30%胁迫下SOD活性增幅分别为45.5%, 54.9%和57.5%。而金心吊兰黄白色部分增幅稍大于其边缘部分, 分别为64.6%, 69.9%和72.5%。在野生型全绿吊兰边缘部分的SOD活性增幅也小于中心部分。

图5

Fig.5

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	图5 干旱胁迫对叶片不同部分SOD活性的影响Fig.5 Effects of water stress on the SOD activity in different parts of leaves

不同浓度PEG-6000胁迫后, POD活性变化趋势显示(图6), 金心吊蓝绿色部分的POD活性显著高于中心黄白色部分(P< 0.05)。随着胁迫时间的增加, 金心吊蓝绿色部分与中心黄白色部分的POD活性先上升后下降的趋势, 都在第4天达到最大值, 分别是各自胁迫处理前POD活性的14.4, 17.5, 30.2倍和4.6, 6.9, 7.9倍。野生型全绿吊兰边缘部分与中心部分也呈现出先上升后下降的趋势, 在开始胁迫时候中心部分的POD活性高于边缘部分, 第4天时, 在30%胁迫浓度下, 野生型全绿吊兰边缘部分POD活性小于中心部分。这可能是在胁迫初期, 金心吊兰体内产生了过量的活性氧自由基 O2-·, 它并未得到及时的清除, 积累在金心吊兰体内, 导致过量H₂O₂的产生, 于是POD便得到大量的表达, 在高浓度PEG-6000胁迫下, 体内产生的H₂O₂较多, 故POD活性显著高于其他材料。

图6

Fig.6

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	图6 干旱胁迫对叶片不同部分POD活性的影响Fig.6 Effects of water stress on the POD activity in different part of leaves

用模糊函数隶属法对金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘和中心部分H₂O₂含量, O2-·含量, MDA含量, SOD活性, POD活性进行综合评价, 得到其隶属函数总平均值, 其中SOD活性, POD活性与抗旱性呈正相关, H₂O₂含量, O2-·含量, MDA含量与抗旱性呈负相关(表1)。金心吊兰黄白色部分, 野生型全绿吊兰中心部分, 金心吊蓝绿色部分, 野生型全绿吊兰边缘部分的总平均值从高到低分别为0.512 7, 0.511 4, 0.495 3, 0.493 7, 说明金心吊兰的黄白色部分抗旱性最高, 全绿吊兰的边缘部分抗旱性最低。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 耐旱指标隶属值及耐旱性综合评价 Table 1 Subordinate function values of drought resistances and comprehensive evaluation of four samples 项目 Item H2O2含量 Content of H2O2 O2-·含量 Content of O2-· MDA含量 Content of MDA SOD活性 Activity of SOD POD活性 Activity of POD 平均值 Average 排名 Order 金心吊兰边缘(绿色)部分Leaf blade part of C. capense var. medio-pictum 0.530 0.684 0.413 0.470 0.380 0.495 3 金心吊兰中心(黄白色)部分Leaf center part of C. capense var. medio-pictum 0.448 0.576 0.572 0.491 0.478 0.513 1 全绿吊兰边缘部分Leaf blade part of C. capense 0.521 0.645 0.408 0.474 0.420 0.494 4 全绿吊兰中心部分Leaf center part of C. capense 0.535 0.532 0.453 0.529 0.508 0.511 2

表1 耐旱指标隶属值及耐旱性综合评价 Table 1 Subordinate function values of drought resistances and comprehensive evaluation of four samples

当植物受到逆境胁迫时, 体内活性氧产生与清除机制失衡, 造成细胞中活性氧迅速积累, 对植物膜脂、蛋白质和其他细胞组分造成伤害, 乃至细胞死亡^[16]。本研究中用不同浓度的PEG-6000模拟干旱胁迫, 通过金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘与中心部分 O2-·、H₂O₂和MDA含量的变化来衡量受到的胁迫程度, SOD与POD活性变化来反映耐旱能力。

金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘与中心部分的 O2-·和H₂O₂含量, 随着胁迫时间和浓度的增加而呈现上升的趋势, 表明金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘与中心部分活性氧代谢平衡被打破, 积累了大量的活性氧。林琪等^[17]发现小麦(Triticum aestivum)旗叶受到不同程度干旱胁迫后, O2-·和H₂O₂含量随着干旱时间的增加而逐渐升高。通常, 当植物受到干旱胁迫后, 体内以SOD、POD为主的保护酶活性会增加, 清除过多的活性氧, 增加其抗逆性, 且抗旱性能力强的植物增加幅度大。本研究中, 金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘与中心部分的SOD和POD活性都随着胁迫时间的增加, 呈先上升后下降的趋势, 随着胁迫浓度的增加而增强, 在第4天达到各自的最大值, 表明金心吊兰受到胁迫后会增加SOD和POD活性, 这是植物细胞对外界胁迫条件的一种适应性反应, 但当干旱胁迫程度过大, 自由基产生与清除平衡失调时, 就会导致SOD和POD活性的降低^[7]。华春等^[18]对毕氏海蓬子(Salicornia bigelovii)幼苗研究得到相同的结果。MDA是膜质过氧化的主要产物, 其含量的变化在一定程度上反映了逆境胁迫对植物的伤害, 其含量的多少代表了细胞膜脂过氧化水平, 反映了植物受胁迫程度的大小^[19]。戴高兴等^[20]报道, 用20% PEG-6000下, MDA含量急剧上升。本研究中, MDA含量一直上升, 在第6天达到各自最大值, 说明它们的膜脂过氧化作用一直增强, 且在30%胁迫浓度时, 对金心吊兰及其野生型全绿吊兰的边缘与中心部分破坏最大。

叶绿素是植物进行光合作用的物质基础, 在光合作用中起着吸能和转能的作用。叶绿素含量的高低在很大程度上反映了叶片光合作用的强弱, 并在一定程度上可以作为叶片衰老的指标^[21]。本研究中, 吊兰叶片的抗旱性与叶绿素含量呈负相关, 即叶绿素含量较高的部分抗旱性较差(表1)。Yuan等^[22]研究发现和野生型相比较, 叶绿素缺少的大麦(Hordeum vulgare)突变体(NYB)对干旱不敏感, 这与本研究的结果相似。金心吊兰叶片的叶绿素含量为215.6 μ g/g, 全绿野生型吊兰叶片的叶绿素含量为367.2 μ g/g, 全绿野生型吊兰叶片的叶绿素含量是金心吊兰叶片的1.7倍(数据未列出), 金心吊兰叶片含有较低的叶绿素含量, 具有较强的抗旱性。

叶绿体是植物细胞内活性氧产生的主要部位, 当植物面临环境胁迫时, 叶绿体、线粒体和过氧化物酶体就会产生过量的活性氧, 从而导致植物对各种胁迫做出应答, 过量的活性氧会与蛋白质, 脂质等发生反应, 破坏植物细胞, 严重会引起植物的死亡^[5]。金心吊兰及其野生型全绿吊兰叶片边缘和中心部分的叶绿体如图1所示, 其分布表现出明显的位置效应, 边缘部分的数量多于中心部分。

金心吊兰及其野生型全绿吊兰叶片的抗旱性呈现位置效应, 同一植株同一叶片的不同叶绿素含量区域, 对干旱胁迫的耐受性不同。本研究中, 金心吊兰中心部分的抗旱性高于其边缘部分(表1)。吊兰叶片抗旱性具有位置效应的原因可能是在其叶片的中部存在大量的维管组织^[8], 主要用于水分和养料的运输。另一方面, 中心部分的叶绿素含量低, 捕获的光能少, 其产生的对自身有害的活性氧自由基也就偏少, 从而面临较低水平的氧化胁迫。关于植物叶片位置相应对抗逆性的影响, 是否具有普遍意义有待进一步研究。

通过隶属函数分析法对金心吊兰及其野生型全绿吊兰的抗旱能力进行综合评价得出:金心吊兰抗旱性高于野生型全绿吊兰, 使得金心吊兰比野生型全绿吊兰更不容易受到干旱胁迫的影响, 这为金心吊兰作为绿化中选择适当的干旱地区栽培提供了一定的理论依据。但是在吊兰体内的抗氧化分子机制如何响应干旱胁迫, 有待进一步研究。