多年生黑麦草品种“ 雅晴” , 由百绿草业公司惠赠。本实验在中国科学院成都生物研究所于2010年9月至2012年4月期间进行并完成。根癌农杆菌EHA105由本实验室保存。植物表达载体p2355由中国科学院成都生物研究所马欣荣实验室在pCAMBIA2301基础上构建, 外源基因由多克隆位点区插入; 中间载体pSK-int由四川省农业科学院黄维藻博士惠赠。载体示意图见图2。

图2

Fig.2

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	图2 载体结构简图Fig.2 The cassette of vectors

根据NCBI中的黑麦草CAD(登录号:AF472591.1)和CCR(登录号:AF278698.1)基因cDNA序列, 选取其中约200300 bp的片段, 应用Primer 6.0软件, 分别设计CAD和CCR正、反向目的片段的上下游2对引物(表1), 正向片段和反向片段引物的扩增序列相同, 而酶切位点不同, 以使目的片段定向插入载体中。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 用于扩增CAD、CCR正、反向片段的寡核苷酸引物 Table 1 Sequences of oligonucleotide primers used for amplification of CAD, CCR fragments 引物名称Primer name 引物序列Primer sequences 酶切位点Restriction site 扩增片段Amplification fragments cad-1 GGATCCGACGATGTGACGATCAAGGTGCTC BamH I CAD正向片段(预期长度268 bp)。CAD forward fragment (expected length 268 bp). cad-2 AAGCTTTGAGCGTCAGGGTGGGGCAGAAGTT Hind III cad-3 GAGCTCGACGATGTGACGATCAAGGTGCTC Sac I CAD反向片段(预期长度268 bp)。CAD reverse fragment (expected length 268 bp). cad-4 GAATTCTGAGCGTCAGGGTGGGGCAGAAGTT EcoR I ccr-1 GGATCCAAGCCGACCTCCTCGACTATGATGC BamH I CCR正向片段(预期长度206 bp)。CCR forward fragment (expected length 206 bp). ccr-2 AAGCTTGCCGATGGACGACGTGAACACC Hind III ccr-3 GAGCTCAAGCCGACCTCCTCGACTATGATGC Sac I CCR反向片段(预期长度206 bp)。CCR reverse fragment (expected length 206 bp). ccr-4 GAATTCGCCGATGGACGACGTGAACACC EcoR I The underlined indicate the sites of restriction enzymes. 下划线部分为酶切位点。

表1 用于扩增CAD、CCR正、反向片段的寡核苷酸引物 Table 1 Sequences of oligonucleotide primers used for amplification of CAD, CCR fragments

预期CAD片段长度256 bp, 加酶切位点12 bp, 共计268 bp; CCR片段长度194 bp, 加酶切位点12 bp, 共计206 bp。

提取新鲜的野生型黑麦草叶片总RNA, 用 RT-PCR试剂盒(TaKaRa)反转录成cDNA, 作为扩增目的片段的模板。用引物cad-1和cad-2、ccr-1和ccr-2分别PCR扩增出CAD和CCR的正向片段(表1)。扩增条件为94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 45 s, (35 个循环); 72℃ 7 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 切下目的条带用DNA Gel Extraction Kit(上海生工)回收后与pMD19-T载体(TaKaRa)连接, 筛选重组子并测序(上海生工), 测序结果用DNAMAN(版本5.2.2)软件进行分析。

以含有CAD或CCR正向片段的重组pMD19-T载体为模板, 分别以cad-3和cad-4、ccr-3和ccr-4为引物, PCR扩增出CAD和CCR的反向片段(表1), 再分别克隆到pMD19-T载体中, 筛选重组子, 酶切验证并测序分析。

含有正向目的片段的重组pMD19-T载体分别经BamH I和Hind III双酶切, 分别回收小片段, 与经相同酶切的中间载体pSK-int连接, 筛选重组子并酶切验证。再将含CAD或CCR反向片段的重组pMD19-T载体分别用EcoR I和Sac I双酶切后, 回收小片段分别插入已经含有CAD或CCR正向片段的重组中间载体相应位点, 筛选重组子, 酶切验证。分别获得含有干扰片段的中间载体pSK-iCAD和pSK-iCCR, 具有发卡结构的干扰片段分别称为iCAD和iCCR。

将重组中间载体分别用BamH I和Sac I双酶切后, 分别获得iCAD 或iCCR目的片段。将目的片段分别插入p2355载体相应位点, 利用变性碱裂解法和双酶切法鉴定重组子。构建的携CAD或CCR目的片段反向重复结构的植物表达载体, 分别命名为p23-iCAD和p23-iCCR, 干扰片段由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35Sp)驱动。

热激法将载体p23-iCAD和p23-iCCR分别导入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中, 保存于液氮备用。

选取成熟的多年生黑麦草“ 雅晴” 种子, 经过表面灭菌后接种于MS基本培养基^[20]中萌发生长。无菌苗可以通过组织培养快速繁殖并长期保存, 每15 d转接1次, 培养基为MS+6-BA 1 mg/L。待试管苗生长到一定长度、分蘖达10个以上时, 取茎节分生区并纵切后置于MS+2, 4-D 5 mg/L愈伤组织诱导培养基中, 诱导愈伤组织生长, 并每隔15 d继代1次, 共继代4次。

将分别含有p23-iCAD和p23-iCCR的根癌农杆菌EHA105均匀涂布在含有50 mg/L Km和20 mg/L Rif的LB平板上, 待长出菌苔后, 刮取适量菌体接种于含200 μ mol/L AS的液体愈伤组织诱导培养基中, 28℃, 200 r/min培养3 h左右, OD₆₀₀为0.20.5即可用于转化。愈伤组织预先用细胞凋亡抑制剂CHO(100 μ mol/L)处理3 h。侵染前, 菌液中加入适量(10 μ L/mL)10%非离子去污剂F68水溶液。愈伤组织于菌液中浸没5 min后, 置于无菌滤纸上吸去附着的菌液, 然后转入含滤纸(每皿加134 μ L灭菌水)的培养皿进行共培养, 22℃。共培养3 d后, 将愈伤组织接入含200 mg/L抗生素Timentin的除菌诱导培养基中, 2426℃培养。7 d后, 将愈伤组织接入含50 mg/L巴龙霉素(paromomycin)的筛选继代培养基(MS+2, 4-D 3 mg/L)中, 2426℃培养, 14 d筛选继代1次, 共3次。上述培养均为暗培养, 培养基配方参见文献[19]。

之后将生长良好的愈伤组织接入含2 mg/L 6-BA、20 μ g/L 2, 4-D、25 mg/L巴龙霉素的分化培养基。待长出苗后, 移入含50 mg/L巴龙霉素的1/2 MS培养基生根培养。待长出根后, 移入含MS+0.1 mg/L IAA+50 mg/L巴龙霉素的筛选培养基进行最后一轮筛选。分化再生培养条件为2426℃, 16 h光/8 h暗培养。2周之后将发育良好的植株移出, 大棚盆栽。

愈伤组织诱导、继代、分化, 以及植株再生培养基, 均参见本实验室配方并优化^[19]。在共培养及选择、分化培养过程中, 均添加5 mg/L AgNO₃。共培养后Timentin持续添加至再生苗移入盆钵前。

使用CTAB法提取植株叶片总DNA作为模板, PCR鉴定CAD、CCR基因目的片段。扩增目的片段上游引物在CaMV35S启动子上, 下游引物分别为cad-2和ccr-2, 产物为正向片段并包括部分启动子序列。预期扩增片段长度分别约为CAD 400 bp, CCR 300 bp。

CaMV35S启动子上的引物35S-1:GACGCACAATCCCACTATCCTTC。反应条件与1.2相同。

根据PCR鉴定结果, 选取PCR阳性植株和野生型植株, 采用紫外分光光度法测定其相对木质素含量^[21]。取各独立的转基因植株全叶片, 置于50℃干燥过夜后研磨成粉末, 每株分成3份, 每份0.006 g, 分别放入10 mL离心管中, 加入25%溴乙酰-乙酸溶液 (w/w) 0.5 mL和高氯酸 0.02 mL, 盖紧管口, 于80℃恒温水浴 40 min, 每隔10 min振荡试管。将反应液完全移入已装有2 mol/L NaOH 1 mL和2.5 mL冰乙酸混合液的10 mL容量瓶内, 振荡, 充分混匀, 并用冰乙酸定容至10 mL。以冰乙酸为空白溶液, 用多功能读数仪(Varioskan Flash spectral scanning multimode reader, Thermo公司)在波长260 nm测定吸光度。利用260 nm处木质素的吸光度作为相对木质素含量。采用数据学软件SPSS 12进行统计学分析。

Lignin%=Abs× Liters× 100%/(Wsample× Astandard)^[21]

式中, Abs为样品溶液木质素吸光度, Liters为样品溶液定容体积(L), Wsample为样品的绝干重量(g), Astandard为黑麦草木质素标准吸光率。根据公式可知, 木质素含量与其吸光度呈正相关。

以多年生黑麦草“ 雅晴” cDNA为模板扩增获得的目的片段, 经克隆测序, 结果表明, 片段长度与预期有差异。CAD片段, 预期长度是256 bp, 实际长度为367 bp, 与预期相差111 bp; CCR预期长度是194 bp, 实际长度为296 bp, 相差102 bp。均不包括添加的酶切位点。

通过DNAMAN(版本5.2.2)软件对测序结果与NCBI中的黑麦草CAD基因序列(登录号:AF472591.1)和CCR基因序列(登录号:AF278698.1)进行比对, 并分析结构, 结果表明获得的片段均包含一段内含子序列。内含子序列长度即是差异的长度, 分别为111和102 bp。去掉内含子, cDNA序列与NCBI数据库中目的基因片段序列同源性分别为92.19%和99.48%(图3和图4)。获得的CAD基因与NCBI中AF472591.1序列存在一定差异, 氨基酸序列比对分析, 同源性为87.06%。结果表明获得的片段为CAD和CCR基因片段。

图3

Fig.3

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	图3 CAD片段同源性分析 (102212为内含子)Fig.3 The sequence alignment of CAD fragment (102— 212 indicate the intron)

图4

Fig.4

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	图4 CCR片段同源性分析 (93194为内含子)Fig.4 The sequence alignment of CCR fragment (93— 194 indicate the intron)

获得的目的片段分别以正反方向插入到载体pSK-int质粒内含子两侧, 构建了重组中间载体pSK-iCAD和pSK-iCCR。用BamH I/Sac I分别双酶切pSK-iCAD和pSK-iCCR, 回收目的片段iCAD和iCCR, 分别插入相同酶切的p2355载体相应位点, 构建了含干扰片段的植物表达载体p23-iCAD和p23-iCCR。iCAD片段长909 bp(正向片段373 bp、内含子163 bp、反向片段373 bp, 其中包含酶切位点12 bp), iCCR片段为767 bp(正向片段302 bp、内含子163 bp、反向片段302 bp, 其中包含酶切位点12 bp), 由CaMV35S启动子驱动。

用BamH I/Sac I双酶切p23-iCAD和p23-iCCR分别得到909和767 bp长的目的片段(图5), 表明CAD和CCR基因正、反向目的片段已经插入到p2355质粒的相应位点, 植物表达载体p23-iCAD和p23-iCCR构建完成(图2)。

图5

Fig.5

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	图5 p23-iCAD和p23-iCCR重组子BamH I和Sac I双酶切验证Fig.5 Identification of p23-iCAD and p23-iCCR by enzymatic digestion

选择生长状态良好、质地致密均一的黑麦草愈伤组织(图6A)经过农杆菌浸染(图6B), 再通过3轮巴龙霉素共计6周筛选后(图6C), 进行分化(图6D)和生根培养 (图6E), 检测鉴定获得转基因植株(图6F)。

图6

Fig.6

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	图6 多年生黑麦草的遗传转化Fig.6 Agrobacterium-mediated perennial ryegrass transformation

携p23-iCAD质粒农杆菌转化多年生黑麦草, 从约3 600个共培养的愈伤组织中, 获得65株正常生长的抗性植株, 138个未分化的抗性愈伤组织, 以及30株抗性白化苗。携p23-iCCR质粒农杆菌转化多年生黑麦草, 从约3 600个共培养的愈伤组织中, 获得78株正常生长的抗性植株, 145个未分化的抗性愈伤组织, 以及32株抗性白化苗。未分化的抗性愈伤组织和白化苗没有应用价值, 淘汰, 未进行后续研究。

观察显示, 转基因植株与野生型相比, 外观表型上没有明显差异, 生长正常(图6F)。

利用抗性植株叶片总DNA作为模板进行PCR验证, 由于CAD和CCR克隆片段分别比预期多出111和102 bp内含子序列, 因此扩增片段亦比预期分别长111和102 bp。扩增CAD 基因正向目的片段的引物为上游CaMV35S启动子引物55-1和cad-2, 片段长度约为500 bp(图7); 扩增CCR基因正向目的片段的引物为上游CaMV35S启动子引物355-1和ccr-2, 片段长度约为400 bp(图8)。

图7

Fig.7

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	图7 PCR检测抗性植株iCAD片段Fig.7 Detecting iCAD fragment of resistant transformant by PCR

图8

Fig.8

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	图8 PCR检测抗性植株iCCR片段Fig.8 Detecting iCCR fragment of resistant transformant by PCR

获得的干扰CAD基因的转基因株系命名为i-CAD, 干扰CCR基因的命名为i-CCR。

根据PCR验证结果, 分别对PCR阳性植株和野生型对照进行相对木质素含量测定。目前对i-CAD阳性和i-CCR阳性各测定了20个独立的转基因植株。提取叶片木质素, 在260 nm测定吸光度(图9)。由于木质素含量与吸光度呈正相关, 因此以野生型的吸光度作为对照, 转基因植株的吸光度与之相比较, 测定相对木质素含量。结果显示, 其中, i-CAD植株有11株、i-CCR植株有9株木质素含量明显降低。图9分别显示了9个木质素含量降低的植株。

图9

Fig.9

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	图9 转基因黑麦草相对木质素含量比较Fig.9 The compare of relative lignin content of transgenic ryegrass

与野生型对照相比, CAD干扰植株木质素含量降低了26.40%45.04%, 平均降低了33.86%; CCR干扰植株木质素含量降低了28.58%50.18%, 平均降低了34.67%。经过方差分析, CAD干扰植株和CCR干扰植株的相对木质素含量与野生型相比差异极显著(P< 0.01), 表明RNA干扰木质素合成途径中的CAD、CCR后, 转基因植株叶片总木质素含量明显降低。

观察表明, 木质素降低的转基因植株与对照相比, 外观形态上没有明显差异, 生长正常(图6F), 但是触摸感觉较柔软。