于2012年12月-2013年4月在甘肃农业大学动物科学技术学院动物训练中心及动物营养实验室进行。

选用石羊河葡萄酒厂的鲜葡萄渣, 自然干燥后用植物粉碎机粉碎, 过1.0 mm筛后用自封袋封装保存备用。

采用4× 4拉丁方试验设计, 每期试验17 d, 其中预试期10 d, 正试期7 d。试验设4个饲粮处理, 处理1为不含葡萄渣的基础饲粮, 处理2至处理4分别为含5%, 10%和15%葡萄渣的饲粮, 各处理的缩合单宁含量分别为0.00, 0.85, 1.70 和2.25 g/kg DM。

选取4只身体健康且安装永久瘤胃瘘管羯羊[萨福克(Suffolk)♂× 小尾寒羊(small tail Han-yang)♀], 年龄约2.5岁, 体重28 kg左右。绵羊单笼饲养, 每只绵羊每天饲喂1 kg饲料。在过渡期每只绵羊均饲喂基础饲粮, 每日8:00和16:00两次等量饲喂, 准确记录每只绵羊采食量。绵羊自由饮水。预试期及正试期按照试验设计饲喂试验饲粮, 饲喂方式和饲养管理制度不变。

参照中国肉羊饲养标准(NY/T 816-2004)中体重30 kg、日增重0.1 kg/d的育成公绵羊营养推荐量配制试验饲粮(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲粮配方及营养成分 Table 1 Composition and nutritional levels of diets 原料 Feed stuff 处理1 Treatment one 处理2 Treatment two 处理3 Treatment three 处理4 Treatment four 饲料配方Composition (%, 风干基础Air dry basis) 苜蓿Alfalfa hay 30.79 23.79 17.99 11.79 小麦秸Wheat straw 23.00 25.00 25.80 27.00 玉米Corn 38.00 38.00 38.00 38.00 豆粕Soybean meal 7.00 7.00 7.00 7.00 葡萄渣Grape pomace 0.00 5.00 10.00 15.00 食盐Salt 0.70 0.70 0.70 0.70 添加剂预混料Premix* 0.51 0.51 0.51 0.51 合计Total 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平Nutritional level 干物质Dry matter (%) 87.41 87.65 87.87 88.09 消化能Digestible energy (MJ/kg) 10.37 10.10 9.89 9.66 粗蛋白质Crude protein (%) 11.21 10.86 10.64 10.37 钙Calcium (%) 0.53 0.48 0.44 0.39 磷Phosphorus (%) 0.22 0.21 0.21 0.20 缩合单宁Condensed tannins (g/kg DM) 0.00 0.85 1.70 2.25 Note: * Additive premix includes: mineral elements (mg/kg): S, 200; Fe, 25; Zn, 40; Cu, 8; I, 0.3; Mn, 40; Se, 0.2; Co, 0.1. Vitamin (IU/kg):VA, 940; VE, 20. The nutrient content of grape pomace were obtained by analyzing really. The ratio of digestible organic matter to dry matter(DOMD) in grape pomace was measured by two-step technique, and then calculated DE by formula DE=ME/0.81 and ME=0.15DOMD from ARC, 注:* 饲粮中微量元素添加量(mg/kg):S, 200; Fe, 25; Zn, 40; Cu, 8; I, 0.3; Mn, 40; Se, 0.2; Co, 0.1。饲粮中维生素添加量(IU/kg):VA, 940; VE, 20。葡萄渣的养分含量为实测值, 两级离体消化试验得到葡萄渣干物质中可消化有机物质的百分含量(DOMD)后, 利用英国ARC代谢能体系中消化能推算公式:DE=ME/0.81, ME=0.15DOMD计算DE[7]。

表1 试验饲粮配方及营养成分 Table 1 Composition and nutritional levels of diets

每期试验的正试期采集饲粮、粪样和尿样。正试期最后1 d在食前及食后2, 4, 6和8 h从绵羊的瘘管中抽取50 mL瘤胃液, 立即测定瘤胃液的pH值, 然后用4层纱布过滤, 收集于采样瓶中, 并加入1 mL饱和HgCl₂溶液使酶灭活, 放入-20℃冰箱冷冻保存。饲料、粪、尿中干物质, 粗蛋白质, 中性洗涤纤维, 酸性洗涤纤维, 钙和磷的测定采用常用方法^[8]; 瘤胃液pH用Sartorius PB-10型酸度计测定; 瘤胃液氨氮采用冯宗慈和高民^[9]改进后的比色法测定; 瘤胃液尿素氮采用二乙酰一肟法测定(试剂盒购自南京建成生物工程所); 饲料和粪样中的能量采用XRY-1C真空弹微电脑自动热量计测定; 瘤胃液挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)采用气相色谱法(安捷伦6890N气相色谱仪)测定。

试验数据用SPSS 16.0统计软件进行拉丁方方差分析, 差异显著时, 采用Tukey法进行多重比较, 并用Excel作图。

处理4绵羊对饲粮氮的消化率极显著高于处理2绵羊(P=0.007)且显著高于处理1绵羊(P=0.019), 处理3绵羊对饲粮氮的消化率显著高于处理2绵羊(P=0.046); 处理4绵羊对饲粮氮的存留率显著高于其他各组绵羊(P=0.012, P=0.016, P=0.025)。其余差异不显著(P> 0.05)(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 绵羊养分表观消化率及氮存留率 Table 2 The apparent digestibility of nutrients and nitrogen retention of sheep% 处理 Treatment 表观消化率Apparent digestibility 氮存留率 Retention of nitrogen 干物质 Dry matter 氮 Nitrogen 有机物 Organic matter 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber 钙 Calcium 磷 Phosphorus 1 65.66± 4.59 59.96± 3.29 ABbc 67.58± 4.72 58.10± 6.57 36.91± 9.25 20.67± 13.00 34.74± 12.73 12.74± 3.18 b 2 65.47± 4.64 57.84± 2.42 Bc 67.32± 4.46 58.74± 5.39 35.89± 6.94 24.14± 17.64 47.40± 13.24 13.33± 3.39 b 3 65.19± 4.37 64.68± 2.83 ABab 67.71± 4.64 59.96± 5.53 36.28± 7.48 19.89± 13.03 46.98± 19.66 14.03± 6.05 b 4 64.44± 3.36 68.35± 2.79 Aa 65.24± 3.35 60.12± 4.05 35.74± 7.31 13.58± 13.03 43.97± 5.83 21.38± 3.62 a P值P value 0.911 0.006 0.777 0.800 0.975 0.837 0.681 0.009 Note: Means with different capital letter within the same column differ significantly (P< 0.01), those with different lowercase letter differ significantly (P< 0.05).The same below. 注:同列数据具不同大写字母者为差异极显著 (P< 0.01); 不同小写字母者为差异显著 (P< 0.05)。下同。

表2 绵羊养分表观消化率及氮存留率 Table 2 The apparent digestibility of nutrients and nitrogen retention of sheep%

处理1绵羊瘤胃液中总氮浓度极显著高于其他各处理绵羊(P=0.003, P< 0.001, P< 0.001); 处理1绵羊瘤胃液中蛋白氮浓度极显著高于处理3绵羊(P=0.001)且显著高于处理4绵羊(P=0.017); 处理4绵羊瘤胃液中尿素氮浓度极显著高于处理2和3绵羊(P=0.003, P< 0.001)并显著高于处理1绵羊(P=0.030)。其余差异不显著(P> 0.05)(表3)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 绵羊瘤胃液中氮浓度 Table 3 Nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep mg/100 mL 处理Treatment 总氮Total nitrogen 氨氮Ammonia nitrogen 尿素氮Urea nitrogen 蛋白氮Protein nitrogen 1 152.04± 34.71 A 54.83± 21.76 8.05± 5.14 ABb 89.16± 48.68 Aa 2 114.13± 31.43 B 52.41± 18.88 7.03± 4.29 Bb 58.61± 32.77 ABab 3 92.91± 29.58 B 49.77± 19.25 5.86± 1.90 Bb 39.83± 35.00 Bb 4 91.35± 35.54 B 54.16± 16.02 11.61± 3.89 Aa 46.48± 37.76 ABb P值P value 0.000 0.839 0.000 0.001

表3 绵羊瘤胃液中氮浓度 Table 3 Nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep mg/100 mL

处理1, 2和3绵羊瘤胃液中总氮浓度动态变化趋势基本一致(图1a), 采食后总氮浓度下降, 食后4 h降至最低值后逐渐升高, 处理4绵羊瘤胃液中总氮浓度食后2 h降至最低值后逐渐升高(图1); 4个处理绵羊瘤胃液中氨氮浓度动态变化趋势基本一致(图1b), 食后2 h氨氮浓度升至最高值后逐渐降低, 在食后6 h降至最低值然后升高; 处理1, 2和3绵羊瘤胃液中尿素氮浓度在食后下降(图1c), 处理1和3在食后4 h降至最低值后升高, 处理2在食后6 h降至最低值后升高, 处理4绵羊食后尿素氮浓度升高, 在食后2 h升至最高值后下降, 食后4 h降至最低值后升高; 4个处理绵羊瘤胃液中蛋白氮浓度动态变化趋势基本一致(图1d), 处理1, 3和4在食后2 h降至最低值, 处理2在食后4 h降至最低值, 然后升高。

图1

Fig.1

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	图1 绵羊瘤胃氮浓度参数动态变化Fig.1 Dynamic changes of nitrogen concentration in ruminal fluid of sheep

处理4绵羊瘤胃液中丙酸摩尔比极显著高于处理1和2绵羊(P< 0.001, P=0.003), 处理3绵羊瘤胃液中丙酸摩尔比极显著高于处理1绵羊(P=0.009); 处理1绵羊瘤胃液中丁酸摩尔比和乙丙比极显著或显著高于处理4和处理3绵羊(P=0.006, P=0.034; P=0.001, P=0.031), 处理2绵羊瘤胃液中乙丙比显著高于处理4绵羊(P=0.028)。其余差异不显著(P> 0.05)(表4)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 绵羊瘤胃液pH、总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度及各种酸的摩尔比 Table 4 The pH, total volatile fatty acids and molar ratio of each acid to total volatile acids in ruminal fluid of sheep 处理 Treatment pH TVFA (mmol/L) 各种酸摩尔比The molar ratio of each acid to TVFA (%) 乙酸/丙酸 Acetate/Propionate 乙酸Acetate 丙酸Propionate 丁酸Butyrate 其他酸Others 1 6.62± 0.29 66.37± 14.12 69.16± 2.11 17.98± 1.51 C 10.38± 1.14 Aa 2.49± 0.76 3.88± 0.44 Aa 2 6.58± 0.26 69.44± 14.96 68.65± 2.02 18.50± 1.56 BC 10.00± 1.46 ABab 2.85± 0.79 3.74± 0.43 Aab 3 6.55± 0.24 69.95± 13.46 68.24± 2.08 19.65± 1.78 AB 9.32± 1.13 ABb 2.79± 0.80 3.51± 0.44 Abc 4 6.57± 0.28 70.38± 14.99 68.06± 1.98 20.38± 1.65 A 9.09± 1.02 Bb 2.47± 0.80 3.37± 0.37 Bc P值P value 0.840 0.811 0.337 0.000 0.004 0.291 0.001

表4 绵羊瘤胃液pH、总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度及各种酸的摩尔比 Table 4 The pH, total volatile fatty acids and molar ratio of each acid to total volatile acids in ruminal fluid of sheep

食后各处理组绵羊瘤胃液中pH、总挥发性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸摩尔比和乙丙比动态变化基本一致(图2)。食后各处理绵羊瘤胃液pH逐渐下降(图2a); 食后各处理绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸升高(图2b), 在食后4 h升至最高值后下降; 食后各处理绵羊瘤胃液乙酸摩尔比和乙丙比升高(图2f), 食后2 h或食后4 h升至最高值, 然后下降; 食后各处理组绵羊瘤胃液丙酸和丁酸摩尔比下降(图2d, e), 食后2 h或食后4 h降至最低值, 然后升高。

图2

Fig.2

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	图2 绵羊瘤胃参数动态变化Fig.2 Dynamic changes of parameters in ruminal fluid of sheep

Barry和Forss (1983)^[10]在试验中给绵羊饲喂长柄百脉根(Lotus corniculatus), 发现随着缩合单宁浓度的上升, 有机物和纤维素的瘤胃降解率均呈下降趋势。单宁对反刍动物消化过程的影响很复杂。单宁结构中的大量酚羟基团和芳香环基团与饲料以及动物体内的蛋白质或酶的肽基、氨基以及羧基等以氢键的形式多位点结合, 形成不易消化的复合物使肠道微生物对氮的有效利用率下降, 导致饲料中养分的消化率下降。Khazaal和Orskov(1994)^[11]在对各种不同缩合单宁含量牧草进行体外试验时, 发现单宁浓度与体外干物质降解率呈负相关。本试验中, 葡萄渣单宁对饲粮干物质、有机物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和磷的表观消化率均没有产生显著的影响, 可能与单宁浓度及来源有关, 因为不同来源单宁对养分降解率的影响存在显著差异^[8], 而且这也说明本次试验中采用的缩合单宁浓度还不能对养分表观消化率产生显著影响。

本次试验中, 处理4绵羊的氮表观消化率显著高于处理2和处理1绵羊, 且氮存留率显著高于其他各组绵羊, 可能与提高绵羊过瘤胃蛋白及降低尿氮排出有关。单宁-蛋白质复合物在瘤胃内不易降解, 会提高粗蛋白质的过瘤胃率, 虽然可能因此而降低瘤胃微生物合成效率, 但饲粮粗蛋白质利用率高时, 可通过降低尿氮排出而提高机体氮存留率。Corté s等(2009)^[12]的研究也发现, 将从朱樱花(Calliandra haematocephala)、大叶千斤拔(Moghamia macro-phylla)和银合欢(Leucaena glauca)中提纯的缩合单宁按照0, 300, 600, 900 mg/g豆粕粗蛋白质的比例添加到豆粕中后, 干物质和粗蛋白质的体外降解率极显著降低且过瘤胃蛋白含量提高。张晓庆等(2010)^[13]的研究也证实, 红豆草(Onobrychis viciaefolia)单宁可通过显著降低绵羊尿氮排出而提高氮存留率。

反刍动物瘤胃液中的总氮包括氨氮、尿素氮、饲料中可溶解的蛋白氮以及菌体蛋白氮等, 饲粮粗蛋白质含量和降解率对瘤胃液总氮有直接影响^[14], 其中, 氨氮浓度是反映反刍动物瘤胃内氮降解的最重要指标。氨氮是反刍动物瘤胃内肽、氨基酸、氨化物、尿素和其他非蛋白氮化合物分解的终产物, 同时又是微生物合成菌体蛋白的原料, 反映饲粮蛋白质的含量、其瘤胃降解特性和微生物的合成状况^[15]。本试验中, 各处理绵羊瘤胃氨氮浓度无差异的情况下, 处理1绵羊瘤胃液总氮浓度极显著高于其他各组绵羊, 说明单宁在抑制饲粮粗蛋白质降解的同时对瘤胃微生物合成也存在负面影响, 从而导致氨的积累。Wang等(2007)^[16]曾报道, 利用红豆草干草饲喂绵羊时导致绵羊瘤胃氨氮浓度显著降低, 这可能与不同试验中单宁浓度与来源不同有关, 本试验中该浓度的葡萄渣单宁对瘤胃微生物的影响更为明显。本次试验中, 各处理绵羊瘤胃总氮和氨氮浓度从食前至食后8 h的变化规律基本一致, 且符合反刍动物瘤胃氮浓度变化的一般规律, 因为王桂瑛等(2005)^[17]认为, 采食为微生物提供了必需的营养, 较强的咀嚼和反刍作用使精料中的蛋白质不断的降解释放, 同时使粗料中的细胞可溶性物质不断的溢出, 使氨氮浓度迅速增至峰值, 随着在瘤胃内被微生物的利用和瘤胃壁的吸收, 氨氮浓度逐渐下降, 在下次采食后会出现回升现象。

瘤胃液尿素氮浓度受饲料内尿素氮含量及其溶解速度、唾液分泌及经瘤胃壁吸收入血液的氨态氮浓度的影响。本试验中, 处理4绵羊瘤胃液中尿素氮浓度显著高于其他处理绵羊, 可能与单宁的涩味刺激唾液分泌并使较多再循环尿素进入瘤胃有关^[18], 但处理2和3绵羊瘤胃液尿素氮浓度却没有呈现出相同变化规律, 是否与单宁含量存在相关, 还需要做进一步研究。

瘤胃液蛋白氮包括饲料蛋白氮中可溶解部分, 微生物蛋白氮及唾液蛋白氮。瘤胃液蛋白氮可反映瘤胃中氨被瘤胃微生物利用的状况^[19]。而饲粮中的可降解蛋白是合成微生物蛋白的主要氮源。本试验中, 单宁的添加显著降低了绵羊瘤胃液蛋白氮浓度, 与单宁抑制饲粮粗蛋白质在瘤胃中降解的结果相符, 此外, 由于单宁对瘤胃微生物产生的不利影响, 最终导致瘤胃液蛋白氮浓度显著降低。

瘤胃液pH是反映反刍动物瘤胃综合发酵水平的重要指标, 它主要受到饲粮性质、有机酸积聚和唾液分泌量等因素影响^{[20, 21]}。Murphy和Kennelly(1987)^[22]与韩正康和陈杰(1988)^[23]指出, 瘤胃内pH值变动范围为5.0~7.5, 呈有规律形式变动, 取决于饲粮性质和摄食后时间, 一般于饲喂后2~6 h达最低值。本试验各处理绵羊瘤胃液pH值随时间的变化趋势大致相同, 也都处于正常变动范围。

饲料中的碳水化合物是动物机体能量的主要来源, 而在反刍动物瘤胃中, 有55%~95%的碳水化合物经瘤胃微生物的降解, 生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖, 经酵解转化成丙酮酸后, 进一步分解成挥发性脂肪酸和ATP^[24]。乙酸、丙酸和丁酸浓度的相对比例不仅受反刍动物采食水平的影响, 而且也受饲粮组成等因素的影响^[25]。本试验中, 单宁对绵羊瘤胃液总酸浓度和乙酸摩尔比没有产生显著的影响, 但显著提高丙酸摩尔比而显著降低丁酸摩尔比和乙丙比, 这可能与单宁抑制瘤胃微生物活性有关, 因为粗饲料降解慢于精饲料, 粗饲料降解抑制会导致乙酸摩尔比降低更多, 导致丙酸摩尔比相对升高而乙丙比相对降低。Ngsmdscng(2006)等^[25]用体外法研究多种植物的发酵情况, 结果发现缩合单宁含量对总挥发性脂肪酸与各种酸的产量均有显著影响, 缩合单宁含量高的植物其丙酸含量显著增高, TVFA和乙酸显著降低, 也与本次试验结果相近。另外, 绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸和各种酸摩尔比例随采食时间推移的动态变化, 也符合瘤胃中养分降解及瘤胃微生物利用变化的规律^[26]。4 结论葡萄渣单宁对绵羊干物质、有机物、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙和磷的表观消化率没有产生显著影响, 但显著提高绵羊氮表观消化率和存留率; 显著降低绵羊瘤胃液总氮和蛋白氮浓度而显著提高尿素氮浓度, 对绵羊瘤胃液氨氮浓度没有产生显著的影响; 显著提高绵羊瘤胃液丙酸摩尔比而显著降低丁酸摩尔比和乙丙比, 对绵羊瘤胃液pH、总挥发性脂肪酸浓度和乙酸及其他酸摩尔比没有产生显著的影响。