引用本文
邬彩霞, 刘苏娇, 赵国琦. 黄花草木樨水浸提液中潜在化感物质的分离、鉴定. 23(5): 184-192
WU Cai-xia, LIU Su-jiao, ZHAO Guo-qi. Isolation and identification of the potential allelochemicals in the aqueous extract of yellow sweet clover ( Melilotus officinalis) . Acta Prataculturae Sinica, 23(5): 184-192  
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黄花草木樨水浸提液中潜在化感物质的分离、鉴定
邬彩霞*, 刘苏娇, 赵国琦
扬州大学动物科学与技术学院,江苏 扬州 225009
*通讯作者。

作者简介:邬彩霞(1978-),女,内蒙古临河人,博士,讲师。E-mail:cxwu@yzu.edu.cn

基金:国家自然科学基金(31101764)和江苏省高校自然科学基金(11KJB230004)资助
摘要

本研究旨在分离、鉴定黄花草木樨水浸提液中的主要化感物质。采用色谱分离、薄层分析和生物活性检测相结合的方法分离出了活性较强的化感物质组分,并通过气质联用(GC-MS)对潜在的化感物质进行了定性分析。结果表明,黄花草木樨水浸提液的乙酸乙酯相中含有多种化感物质,相对含量最高的为香豆素,相对含量较高的有6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo[4,1,0]heptan-2-ol、二氢苯并吡喃酮、2,6-二叔丁基对甲酚、二溴三甲基环丙烷、磷酸三甲酯等物质;将乙酸乙酯相进一步分离得到3层混合物,上层混合物中含量相对最高的为香豆素;中层混合物中含量相对较高的有二溴三甲基环丙烷、6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1,5,5-trimethy-7-oxabicyclo[4,1,0]heptan-2-ol、2,6-二叔丁基对甲酚、甲基环戊醇等物质;下层混合物中含量相对较高的有二溴三甲基环丙烷、甲基环戊醇、环己基溴化膦等物质。乙酸乙酯相及其分离后的各层混合物处理对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长均具有一定的化感作用,其中,乙酸乙酯相处理对多花黑麦草化感抑制作用最强,其处理对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的抑制作用显著强于其分层后的各层混合物处理( P<0.05);其次是上层混合物处理,其处理对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的抑制作用显著强于其他2层( P<0.05);下层混合物处理对多花黑麦草的种子萌发和幼苗生长则具有明显的促进作用( P>0.05)。以上结果提示,黄花草木樨水浸提液中化感物质种类非常多,香豆素的含量最高,且香豆素含量高的组分处理对黑麦草的抑制作用就强,推测香豆素应为黄花草木樨水浸提液中的主要化感物质之一。

关键词: 黄花草木樨; 色谱分离; GC-MS; 化感物质; 香豆素
中图分类号:S551+.601 文献标志码:A 文章编号:1004-5759(2014)05-0184-09
Isolation and identification of the potential allelochemicals in the aqueous extract of yellow sweet clover ( Melilotus officinalis)
WU Cai-xia, LIU Su-jiao, ZHAO Guo-qi
College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract

This study aimed to isolate and identify the main allelochemicals of aqueous extract of yellow sweet clover ( Melilotus officinalis). Chromatographic separation, TLC analysis and bioassay test were conducted to isolate the potential allelochemicals of the aqueous extract of yellow sweet clover. GC-MS were used to identify the potential allelochemicals of the aqueous extracts of yellow sweet clover. The results showed that the ethyl acetate phase of yellow sweet clover aqueous extracts containing a variety of allelochemicals, in which coumarin had the highest relative content, then followed by 6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo-[4,1,0]heptan-2-ol, chromanone,2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol, 2-Bromo-1,1,3-trimethyl cyclopropane, trimethyl phosphate, and other substances. The ethyl acetate phase was further separated into three fractions, which were the upper layer, middle layer and lower layer. The chemical which had the highest relative content of the upper layer is also coumarin. In the middle layer, 2-Bromo-1,1,3-trimethyl cyclopropane, 6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1,5,5-trimethy-7-oxabicyclo[4,1,0]heptan-2-ol, 1-Methylcyclopentanol, trimethyl phosphate and 2-Bromo-1,1,3-trimethyl cyclopropane had higher relative contents. In the lower layer, 2-Bromo-1,1,3-trimethyl cyclopropane, 1-Methylcyclopentanol and cyclohexyl-phosphonous dibromide had higher relative contents. The ethyl acetate phase and the fractions separated from it all showed allelopathic effect on the seed germination and seedling growth of Italian ryegrass, in which the ethyl acetate phase treatment showed the strongest inhibition on seed germination and seedling growth of Italian ryegrass, and significantly stronger than all the treatments of the fractions separated from it ( P<0.05). The upper layer treatment showed the second strongest inhibition and significantly stronger than the other two layers ( P<0.05). While the lower layer treatment showed significant promoting effects on seed germination and seedling growth of Italian ryegrass ( P<0.05). These results suggested that many allelochemicals existing in the aqueous extract of yellow sweet clover, in which coumarin had the highest relative content, and the treatments with higher content of coumarin concentration showed stronger inhibition effect on Italian ryegrass, which also suggested that coumarin should be one of the main allelochemicals in the aqueous extract of yellow sweet clover.

Keyword: yellow sweet clover; chromatographic separation; GC-MS; allelochemicals; coumarin

黄花草木樨(Melilotus officinalis)为豆科草木樨属植物, 适应能力强, 具有很高的生物量产量和固氮能力, 能最大限度地减少水土流失和改良土壤[1, 2], 也是极好的蜜源和花粉植物[3]; 黄花草木樨还可以入药, 它可以作为抗凝血剂(双香豆素及其衍生物)用于减少手术后血块凝结[3]并用于治疗脂肪团[4]。此外, 黄花草木樨还具有很强的化感作用, 其水浸提液对多花黑麦草(Lolium multiflorum)、婆婆纳(Veronica persica)、早熟禾(Poa pratensis)等植物的种子萌发和幼苗生长有显著的抑制作用[5], 其刈割后的残茬能有效控制当季田间杂草[6], 作为绿肥栽培, 刈割翻埋后能显著减少田间杂草, 如多年生杂草蒲公英(Taraxacum officinale)和苦菜(Sonchus arvensis), 以及一年生杂草地肤(Kochia scoparia), 播娘蒿(Descurainia sophia), 俄罗斯蓟(Salsola iberica)和旱雀麦(Bromus tectorum)等[7], 或者田间施用黄色草木樨干草粉也能显著抑制杂草生长[5], 所以, 黄花草木樨被认为可以通过间作、翻埋或覆盖等方式作为天然除草剂来控制田间杂草。

化感物质的分离、鉴定和验证是植物化感作用研究的重要组成部分[8]。化感物质被认为是比化学除草剂更安全和对环境友好的生物除草剂, 迄今为止, 一些化感物质已被分离和研究出来以开发新的天然除草剂[9]。因此, 如果能找到草木樨的主效化感物质, 或许可以开发成为新型生物除草剂, 以减少人类对化学除草剂的依赖。国内外许多学者很早就开始对草木樨属植物的化学成分进行了研究, 从中分离出了香豆素、黄酮、酚酸、三萜、皂苷类化合物[10, 11], 但都是从药理特性方面进行分析研究的。然而, 到目前为止, 关于黄花草木樨的化感活性物质只有少数报道, Mací as等[12, 13]分离出一些酚类物质和极性化合物, 鉴定为黄花草木樨的潜在化感物质; 邬彩霞等[14]发现酚酸类化合物存在于黄花草木樨的水浸提液中, 且其含量和水浸提液的化感作用强度相关。但黄花草木樨的主要化感物质, 或者作用最强的化感物质仍然未知。本研究借鉴了Takemura等[15]的方法, 拟采用有机溶剂萃取、层析、色谱分离、GC-MS等方法将黄花草木樨水浸提液中的主要化感物质进行提取、分离、鉴定, 为黄花草木樨化感作用的深入研究提供理论基础。

1 材料与方法
1.1 植物材料与试剂

以黄花草木樨为供体植物, 2011年10月25日播种于江苏省扬州大学试验田, 2012年4月中旬于花期采集新鲜植株; 以多花黑麦草为受体植物; 种子均购于北京正道生态科技有限公司。

分析纯:石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮。色谱纯:甲醇、乙腈、丙酮。均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄花草木樨水浸提液的制备 取黄花草木樨新鲜植株100 g, 剪成2 cm长, 用1000 mL蒸馏水4℃浸提72 h, 获得10%(w/v) 的水浸提液。水浸提液经过二重过滤:第一重用定量滤纸过滤; 第二重用滤元单位为0.45 μ m的滤膜过滤。得到不含微生物的水浸提液, 置于4℃冷藏备用。

1.2.2 黄花草木樨水浸提液不同极性有机相萃取 主要化感物质的分离参考Bertin等[16]的方法, 并适当加以改进。将制备好的黄花草木樨水浸提液10 L用旋转蒸发仪(45℃, -0.1MPa)减压浓缩, 浓缩至1 L。再用3种极性递增的有机试剂(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)依次萃取浓缩液, 每种有机溶剂萃取3次, 合并萃取液, 除水(无水Na2SO4过夜处理)后浓缩、低温干燥后收集各组分萃取物, 称重, 并配制水溶液做化感活性的生物检测。

1.2.3 化感物质生物活性的测定 将50粒供体植物多花黑麦草种子用1%的NaClO浸泡30 min后, 播入铺有石英砂、直径为9 cm的培养皿中, 加入10 mL化感物质处理液, 播种3和6 d后分别计算种子的发芽率, 播种6 d后从每个培养皿中随机取10株幼苗, 测定其根长和苗长, 并测定这10株幼苗的干重。

1.2.4 黄花草木樨水浸提液乙酸乙酯萃取物中主要化感物质的分离和鉴定 对各萃取物进行生物活性的测定后, 将活性较强的乙酸乙酯萃取物用硅胶柱(硅胶:300~400目; 层析柱:直径30 mm, 高度450 mm, 口径24 mm)进行层析分离。采用湿法装柱, 将300~400目柱层析硅胶装入层析柱内, 并用空气泵压实, 排净空气。用薄层层析色谱法以及紫外分析仪不断摸索得到的洗脱剂(乙酸乙酯∶ 石油醚=2∶ 3)进行洗脱, 经薄层层析结合紫外分析仪分别收集显色的成分, 将黄花草木樨水浸提液的乙酸乙酯萃取物分出上层、中层和下层3层混合物, 分别用旋转蒸发仪旋干后收集, 取部分配制水溶液进行生物检测, 部分经气质联用色谱仪确定各混合物中的主要成分。

1.2.5 化感物质检测的仪器条件 气质联用仪(Trace DSQII, 美国Thermo Fisher Scientifc)色谱条件。色谱柱:Stabilwas-DA 30 mm× 0.25 mm× 0.32 μ m石英毛细管柱。起始温度50℃, 保持3 min, 以10℃/min升温至300℃, 以20℃/min升温至330℃。进样量1 μ L。

1.3 数据处理和统计方法

采用SPSS(Ver.16.0)对数据进行单因素方差分析以及差异显著性分析。采用Excel 2003进行作图。

抑制率IR(inhibition rate, %)的计算参考Chung等[17]的方法, 计算公式如下:

IR(%)= 对照值-处理值对照值× 100%

当IR> 0时, 表示为抑制作用; 当IR< 0时, 表示为促进作用。IR的绝对值代表作用强度的大小。

2 结果与分析
2.1 黄花草木樨水浸提液乙酸乙酯萃取物对多花黑麦草幼苗生长的影响

如图1, 黄花草木樨水浸提液浓缩分离后的乙酸乙酯相及其分层后的3层混合物对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长均具有一定的化感作用, 其中, 乙酸乙酯相及其上层混合物处理与对照相比均显著抑制了多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的各项指标(P< 0.05)。乙酸乙酯相处理的抑制作用均为最强, 对3 d发芽率、6 d发芽率、幼苗根长、茎长和苗干重的抑制率分别为83.02%, 20.14%, 91.06%, 40.22%, 67.50%, 且显著高于其分离得到的上、中、下层3层混合物的处理(P< 0.05); 上层混合物处理对多花黑麦草的抑制率次之, 对3 d发芽率、6 d发芽率、幼苗根长、茎长和苗干重分别为45.99%, 6.25%, 81.89%, 14.88%和49.16%; 中层混合物处理则只对多花黑麦草种子3 d发芽率和幼苗根长具有显著的抑制作用(P< 0.05); 下层混合物处理对多花黑麦草的种子萌发和幼苗生长则表现出明显的促进作用, 对多花黑麦草种子3 d发芽率、根长、茎长、干重的抑制率均为负值, 分别为-11.11%, -2.74%, -9.27%和-0.83%, 且与其他处理之间差异显著(P< 0.05)。

图1 乙酸乙酯各层提取物对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的抑制率Fig.1 Inhibition rate of Italian ryegrass seed germination and seedling growth treated by ethyl acetate extract

2.2 黄花草木樨水浸提液乙酸乙酯提取相中化感物质的检测

2.2.1 乙酸乙酯相潜在化感物质的检测 采用气质联用色谱仪(GC-MS)分析乙酸乙酯相中潜在的化感物质, 结果发现检测到约25种物质, 其中的12种相对含量较高, 具体鉴定见表1。其中, 相对含量最高的物质出峰时间在14.51 min, 经鉴定为香豆素, 其相对含量远高于其他物质(图2)。

表1 乙酸乙酯相中的主要化学成分 Table 1 The main chemical composition of ethyl acetate phase

图2 乙酸乙酯相的GC-MS图Fig.2 GC-MS chromatogram of ethyl acetate phase

2.2.2 乙酸乙酯上层潜在化感物质的检测 采用气质联用色谱仪(GC-MS)分析乙酸乙酯上层中潜在的化感物质, 检测到23种物质, 其中的5种相对含量较高, 具体鉴定结果见表2, 其中主要物质的峰出现在14.55 min, 经鉴定为香豆素, 其相对含量远高于上层其他物质(图3)。

表2 乙酸乙酯相分离出的上层的主要化学成分 Table 2 The main chemical composition of upper layer stratified from ethyl acetate phase

图3 乙酸乙酯相分离出的上层物质的GC-MS图Fig.3 GC-MS chromatogram of upper layer stratified from ethyl acetate phase

2.2.3 乙酸乙酯中层潜在化感物质的检测 采用气质联用色谱仪(GC-MS)分析乙酸乙酯中层中潜在的化感物质, 结果检测到25中化学物质, 其中的12种相对含量较高(图4), 具体鉴定结果见表3, 其中几种主要物质鉴定分别为二溴三甲基环丙烷、6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1, 5, 5-trimethy-7-oxabicyclo[4, 1, 0]heptan-2-ol、2, 6-二叔丁基对甲酚、甲基环戊醇等。

图4 乙酸乙酯相分离出的中层物质的GC-MS图Fig.4 GC-MS chromatogram of middle layer stratified from ethyl acetate phase

表3 乙酸乙酯相分离出的中层中主要化学成分 Table 3 The main chemical composition of the middle layer stratified from ethyl acetate phase

2.2.4 乙酸乙酯下层潜在化感物质的检测 采用气质联用色谱仪(GC-MS)分析乙酸乙酯下层中潜在的化感物质, 结果检测到25种化学物质, 发现其中的11种物质相对含量较高(图5), 具体鉴定见表4。其中几种主要物质鉴定分别为二溴三甲基环丙烷、甲基环戊醇、环己基溴化膦等。

图5 乙酸乙酯相分离出的下层物质的GC-MS图Fig.5 GC-MS chromatogram of lower layer stratified from ethyl acetate phase

表4 乙酸乙酯相分离出的下层的主要化学成分 Table 4 The main chemical composition of lower layer stratified from ethyl acetate phase
3 讨论

本研究提取、分离、鉴定了黄花草木樨水浸提液中潜在的化感物质。很多关于化感物质的提取、分离、鉴定的研究中[18, 19], 都采用有机溶剂直接浸泡植物体来提取更多的化感物质, 此类方法尽管可以尽可能的提高植株中化感物质的提取量, 但可能出现的情况是提取到的物质并不是植物在自然条件下能释放到周围环境中并表现出化感活性的物质, 即不能称之为化感物质。在自然条件下, 活体植物是通过根系分泌、茎叶淋溶、挥发及残株腐解等形式向环境释放某些化学物质, 所以, 采用水浸提植物体中的化感物质, 提取到的活性物质更能真实反映植物体的化感物质组成[20]。因此, 本文采用了水浸提液为分析黄花草木樨化感物质的基础条件。

化感物质的分离纯化大多采用的是色谱分离法, 其原理是利用不同物质在固定相和流动相这两相中不同的平衡分配和吸附系数进行分离纯化[21]。色谱分离法的种类很多, 在化感活性物质的分离纯化过程中主要应用的是:用于初步分离的柱色谱分离法、用于检测的薄层色谱法(TLC)和用来纯化的制备色谱仪(制备TLC或HPLC)。在化感物质的结构鉴定方面主要依据的是:熔点、红外光谱、紫外光谱、液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)[22]、毛细管电泳(CE)和核磁共振谱(NMR)等参数来判断物质中存在的功能团、共轭体系、分子量、分子结构以及H原子和C原子在分子中的结合方式等信息, 从而确定化感物质的化学结构, 最后再根据测定出的结构用已知的标准品数据对照, 最终确定这种物质[8]。本文即采用了层析柱和薄层色谱分析法, 分离了黄花草木樨水浸提液乙酸乙酯萃取相中的潜在化感物质, 并采用GC-MS 技术检测、鉴定了其中相对含量较高的主要成分。结果发现, 乙酸乙酯相中含有的物质种类非常复杂, 这些物质主要属于8类化合物, 分别为香豆素类(香豆素和3, 4-二氢香豆素)、醇类[1-甲基环戊醇, 3-甲基环戊醇, 6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1, 5, 5-trimethyl-7-oxabicyclo[4, 1, 0]heptan-2-ol, 叔丁基过氧化氢]、酯类(磷酸三甲酯)、烷烃类(反式-3, 4-环氧辛烷, 2-溴-1, 1, 3-三甲基环丙烷和正十一烷)、酮类(二氢苯并吡喃酮)、苯酚类(2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、酰胺类(芥酸酰胺, 油酸酰胺)和磷化氢类(环己基膦二溴化物)。其中含量最高的物质为香豆素, 其次为6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1, 5, 5-trimethyl-7-oxabicyclo[4, 1, 0]heptan-2-ol、二氢苯并吡喃酮、2, 6-二叔丁基对甲酚、二溴三甲基环丙烷、磷酸三甲酯等物质; 将乙酸乙酯相进一步分离后, 得到3层混合物:上层、中层、下层, 经过GC-MS检测发现上层混合物中相对含量较高的主要为香豆素, 中层混合物中含量相对较高的有二溴三甲基环丙烷、6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1, 5, 5-trimethy-7-oxabicyclo[4, 1, 0]heptan-2-ol、2, 6-二叔丁基对甲酚、甲基环戊醇等物质; 下层混合物中含量相对较高的有二溴三甲基环丙烷、甲基环戊醇、环己基溴化膦等物质。由于乙酸乙酯相中的化学成分非常复杂, 在本文中只鉴定了那些相对含量较高的物质, 而乙酸乙酯相分离后3层混合物的检测到的一些相对含量较高的成分, 在未分离纯化前, 即在乙酸乙酯相中的含量非常微小, 所以, 在乙酸乙酯相的成分分析中没有标出这些物质, 也是结果中(表1~表4)乙酸乙酯相分离前后分析出的主要成分有差异的原因。但是, 总体来看, 乙酸乙酯相分离前和分离后, 相对含量较高的物质是一致的。

检测出的物质中, 香豆素为已报道的具有较强化感活性的化感物质[23, 24], 香豆素不仅可以抑制其他植物生长[23], 还具有杀虫[25]、抗菌[26]等生物活性, 被认为是非常有应用前景的化感物质[24]。也有研究[27, 28, 29]发现2, 6-二叔丁基对甲酚为一些植物的化感物质, 但在生物检测中, 其化感活性并不是很强。检测出的其他物质多数均为新发现的化感物质。本研究结果表明, 香豆素在整个乙酸乙酯相以及乙酸乙酯上层提取物中的相对含量均远高于其他物质(图2, 图3); 生物检测结果(图1)显示, 乙酸乙酯相处理对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的化感抑制作用最强, 其处理的多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的各项指标抑制率均显著高于相同浓度的乙酸乙酯上层、中层和下层提取物处理; 而上层混合物处理对多花黑麦草种子萌发和幼苗生长的抑制作用又明显高于中层和下层提取液。由以上结果或许可以推测, 香豆素为乙酸乙酯提取液中主要的化感物质之一, 其在黄花草木樨的化感抑草作用中可能扮演重要角色。Takemura等[15]将强化感植物墨西哥丁香(Gliricidia sepium)的浸提液进行分离、鉴定时也发现, 香豆素含量最高的组分对生菜(Lactuca sativa)的化感抑制作用最强, 且经过分析浸提液中香豆素的含量及其对综合化感效应的贡献, 发现香豆素为其浸提液化感作用中发挥关键作用的物质, 即为其主效化感物质。此外, 6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1, 5, 5-trimethyl-7-oxabicyclo[4, 1, 0]heptan-2-ol、二氢苯并吡喃酮等新发现的化感物质在乙酸乙酯相和乙酸乙酯中层混合物中的含量也相对较高, 而乙酸乙酯中层混合物处理的多花黑麦草种子萌发或幼苗生长也受到显著的抑制作用, 因此, 这几种物质也可能具有较高的化感抑草潜力, 在下一步的研究中, 将用这几种物质的化学纯品进行生物检测验证, 以进一步明确黄花草木樨的主效化感物质。

乙酸乙酯相对多花黑麦草的抑制作用显著高于分离出来的每一层物质, 这一结果还说明乙酸乙酯相中的化感物质之间存在一定的协同效应。植物水浸提液提取物所表现出来的化感活性往往不是单一物质在发挥作用, 而是几个或几类化合物综合作用的结果, 所以化感效应的强弱不仅取决于化学物质的种类和浓度, 更取决于不同化感物质之间的拮抗和协同作用。

4 结论

黄花草木樨水浸提液的乙酸乙酯相是化感抑制活性较高的组分, 其中含有的物质种类非常复杂, 其中相对含量最高的物质为香豆素, 还包括二氢苯并吡喃酮、2, 6-二叔丁基对甲酚6-(3-Hydroxy-but-1-enyl)-1, 5, 5-trimethyl-7-oxabicyclo[4, 1, 0]heptan-2-ol等相对含量较高的化合物; 将乙酸乙酯相进一步分离得到的3层混合物, 上层混合物的化感活性最强, 且其中相对含量最高的物质仍然为香豆素, 推测香豆素可能是黄花草木樨水浸提液中主要的化感物质。

The authors have declared that no competing interests exist.

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