1.1.1 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)用于植物病原真菌的培养和对峙试验、肉汁胨培养基(NA)用于内生细菌的分离、纯化和保存等^[15], 金氏(King)培养基用于产IAA试验, Pikovaskaia培养基(PKO)和蒙金娜培养基分别用于溶解无机磷和有机磷试验。

1.1.2 供试菌 供试内生细菌:2012年7月分离自东祁连山高寒草地醉马草根和叶的内生细菌。

供试病原菌:马铃薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes), 马铃薯枯萎病菌(Fusarium avenaceum)和马铃薯坏疽病菌(Phoma foveata), 由甘肃农业大学草业学院植物病理实验室提供。

将醉马草组织用自来水清洗表面, 晾干后称取2 g, 表面消毒后置于无菌研钵中研碎, 吸取植物组织研磨浸出液按10倍浓度梯度稀释后, 取0.2 mL涂布于NA培养基, 以最后一次洗涤水为对照, 28℃培养3~7 d, 根据菌落形态、颜色、大小、边缘整齐度及表面形态等分类, 并纯化后4℃保存备用^[16]。

1.3.1 拮抗能力测定 采用平板对峙法^{[5, 15, 17]}测定抑菌效果。用直径5 mm打孔器取指示菌菌块置于PDA 平板中央, 在其四周等距离接种活化后的内生细菌, 4次重复, 马铃薯坏疽病菌置于20℃培养, 其他指示菌置于28℃培养, 至对照满皿后测量菌落直径, 计算抑菌率。

1.3.2 固氮能力测定 供试内生细菌菌悬液0.2 mL接种于阿须贝无氮平板和液体培养基内, 以无菌水为对照, 3次重复, 平板置于28° C培养箱培养, 液体培养基置于120 r/min振荡培养, 第7 天平板上有菌落和液体培养基变浑浊者为阳性, 记为“ +” , 否则记为“ -” 。

1.3.3 溶磷能力测定 将0.2 mL菌悬液涂布于Pikovaskaia’ s培养基(PKO)^[18]上, 28℃培养14 d后观察解磷圈, 3次重复; 根据解磷圈与菌落直径比值大小确定其溶磷能力。

1.3.4 产IAA能力测定 采用Salkowski比色法^[19]。将0.1 mL菌悬液分别接种于含100 mg/L色氨酸和不含色氨酸的金氏培养液中, 以加等量无菌水为对照, 于28℃、120 r/min恒温振荡培养12 d, 取50 μ L加入等量比色液(PC比色液或S2比色液), 室温静置15 min后, 观察显色反应, 3次重复均变红色表示能分泌IAA, 记“ +” , 否则记“ -” 。

1.4.1 培养形状观察^[20] 在NA固体培养基上观察内生细菌菌落形态特征并描述和照相。

1.4.2 形态观察 内生细菌在NA平板上经18~24 h活化培养后革兰氏染色和镜检, 观察菌体颜色和形态, 随机测量30个菌体的长和宽, 并显微拍照。

1.4.3 16S rDNA鉴定^[5] 利用16S rDNA通用引物, 其序列为:引物1为 5'-CCG GAT CCA GAG TTT GAT CAT GGC TCA GCA-3', 引物2为 5'-CGG GAT CCT ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'。内生细菌活化后在LB培养液28℃振荡过夜培养, 后按上海生工试剂盒说明书提取DNA, 经电泳检测具特异性DNA条带的样品进行PCR扩增。扩增体系为:10× buffer 2.5 μ L, dNTP(5 mmol/L)0.5 μ L, MgCl₂(25 mmol/L)2.5 μ L, TaqDNA聚合酶(5 U/μ L)0.3 μ L, 引物(10 μ mol/L)1和2各0.5 μ L, 模板DNA 0.5 μ L(以加0.5 μ L ddH₂O为对照), 补ddH₂O至25 μ L; 扩增程序为:95℃预变性5 min; 94℃变性30 s; 65℃退火40 s; 72℃延伸90 s; 30个循环; 72℃延伸8 min。经电泳检测在1500 bp处具特异性条带的扩增产物测序, 与GenBank数据库中序列相似性比较(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi), 并用Clustal(1.8)软件进行多重序列比较和用Mega(4.0)软件构建系统发育树, 确定其系统发育学地位。

从接种醉马草组织浸提液的平板上依据菌落形态、颜色和大小等挑取不同单菌落, 反复划线纯化后从醉马草中分离出6株内生细菌, 其中根部4株, 叶部2株, 分别编号为261MG1、261MG2、261MG3、261MG4、261MY5和261MY6, 保存备用; 对照没有细菌菌落长出, 说明表面消毒彻底, 所得细菌均为内生细菌。

经对峙培养, 261MY5对3种指示菌的拮抗作用均较差, 其他5株内生菌株对3种指示菌均有较强的抑菌作用, 其中对马铃薯坏疽病菌最强为261MY6, 其抑菌率为69.62%, 最弱为261MG3, 其抑菌率为55.69%; 对马铃薯枯萎病菌最强为261MY6, 其抑菌率为64.51%, 最弱为261MG1, 其抑菌率仅为27.68%; 对马铃薯炭疽病菌最强为261MY6, 其抑菌率为83.65%, 最弱为261MG2, 其抑菌率也达73.39%。综合来看, 对马铃薯炭疽病的拮抗作用最明显, 其中261MY6对3种指示菌的拮抗作用最强, 其抑菌率最低也达69.62%, 最高达83.65%(图1, 表1)。该结果说明6株醉马草内生细菌均具有抑菌能力, 且多个菌株均具有一菌多防功能, 在微生物农药开发中潜力巨大。

图1

Fig.1

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	图1 261MY6的抑菌作用Fig.1 The antagonism effect of 261MY6

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 醉马草内生细菌的生物功能测定 Table 1 Determination of biological functions on endophyte bacterium from A. inebrians 菌株 Strain 抑菌作用 Antagonism effect (%) 固氮能力 Nitrogen fixation 溶磷能力 Phosphorus solubilizing (d/D) 产IAA能力 Secreting IAA 马铃薯坏疽病 P. foveata 马铃薯枯萎病 F. avenaceum 马铃薯炭疽病 C. coccodes 无机磷Inorganic phosphorus 有机磷 Organophosphate 含色氨酸With tryptophan 不含色氨酸 Without tryptophan 261MG1 66.77 27.68 77.88 + - - + + 261MG2 63.61 52.21 73.39 + - - + + 261MG3 55.69 49.82 78.21 + 1.12 - + + 261MG4 66.13 50.17 78.52 - 1.21 - + + 261MY5 31.25 23.65 34.25 + - - + + 261MY6 69.62 64.51 83.65 + 1.07 - + + “ -” :Without biological function; “ +” :With biological function. “ -” :无功能; “ +” :有功能。

表1 醉马草内生细菌的生物功能测定 Table 1 Determination of biological functions on endophyte bacterium from A. inebrians

6株醉马草内生细菌中除261MG4外均能固氮, 但均不能溶解有机磷, 261MG4, 261MG3和261MG6对无机磷有较弱的溶解能力, 6株内生细菌均能产IAA(表1)。该结果说明醉马草内生细菌具有功能多样性。

2.3.1 培养形状观察 261MG1:菌落直径3 mm, 圆形, 边缘整齐, 表面褶皱, 中心凹陷, 呈草帽状, 较干燥, 整体呈淡红色, 可产生红色色素致培养基变红(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 内生细菌的培养性状Fig.2 Culture character of endophyte bacterium from A. inebrians

261MG2:菌落直径13 mm, 不规则形, 边缘不整齐, 表面褶皱, 中心凹陷, 较湿润, 产生红色色素致培养基变红(图2)。

261MG3:菌落直径5 mm, 椭圆或圆形, 边缘整齐, 表面褶皱, 菌落中央低陷, 呈草帽状, 菌落呈淡红色(图2)。

261MG4:菌落直径2 mm, 圆形, 边缘整齐, 中心凹陷, 呈草帽状, 菌落为淡红色(图2)。

261MY5:菌落直径4 mm, 圆形, 边缘整齐, 菌落隆起呈台状, 半透明, 米白色(图2)。

261MY6: 菌落直径3 mm, 圆形, 边缘整齐, 表面褶皱, 中央稍低陷, 奶白色(图2)。

从6株内生细菌培养性状看醉马草内生细菌在形态上存在多样性。

2.3.2 形态观察 6株醉马草内生细菌均为革兰氏阳性和杆状(图3), 但菌体大小差别较大, 菌体最长的为261MG3, 其长度达2.09 μ m, 菌体最宽的为261MG2, 其宽度为0.77 μ m, 其他菌株长和宽介于这两数值间(表2)。

图3

Fig.3

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	图3 内生细菌的革兰氏染色Fig.3 Gram stain of endophyte bacterium from A. inebrians

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 内生细菌的形态特征 Table 2 Morphological character of endophyte bacterium from A. inebrians 菌株 Strain 大小 Size (μ m) 革兰氏染色 Gram stain 形状 Morphology 261MG1 1.74× 0.46 G+ 杆状Rod 261MG2 1.59× 0.77 G+ 杆状Rod 261MG3 2.09× 0.56 G+ 杆状Rod 261MG4 1.56× 0.62 G+ 杆状Rod 261MY5 1.77× 0.51 G+ 杆状Rod 261MY6 2.04× 0.71 G+ 杆状Rod G+: Gram-positive bacteria. G+: 革兰氏阳性菌。

表2 内生细菌的形态特征 Table 2 Morphological character of endophyte bacterium from A. inebrians

2.3.3 16S rDNA鉴定 获得的序列与GenBank数据库中序列比对和构建系统发育树表明, 261MG1、261MG2、261MG3和261MY6分别与芽孢杆菌属的Bacillus subtilis(JX848636)、Bacillus axarquiensis(GU568194)、Bacillus mojavensis(JF496257)和Bacillus amyloliquefaciens(KC752450) 的一致性在99%以上, 且在系统发育树上聚在一起(图4), 初步将

其分别鉴定为芽孢杆菌属的Bacillus subtilis、Bacillus axarquiensis、Bacillus mojavensis和Bacillus amyloliquefaciens, 261MG4与Brevibacterium halotolerans (HE970648)的一致性在99%以上, 且在系统发育树上聚在一起(图4), 初步鉴定其为短杆菌属的Brevibacterium halotolerans, 261MY5与Clavibacter sp.(JX164054)的一致性在99%以上(图4), 且在系统发育树上聚在一起, 初步鉴定其为棒形杆菌属细菌。该结果表明, 6株内生细菌分属于3个属6个种, 说明醉马草内生细菌也具有种类多样性, 但芽孢杆菌属细菌4株, 占66.7%, 为优势类群。

图4

Fig.4

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	图4 醉马草内生细菌的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of endophyte bacterium from A. inebrians