试验在湖南省畜牧兽医研究所奶牛原种场进行, 试验期为2013年6月7日至7月16日, 其中, 前7 d为预饲期。

由衡阳市某饲料添加剂有限公司研制生产并提供。根据中医药理论, 选用具有清热解暑、凉血解毒、益气养阴、加强免疫机能的中药材进行组方, 包括王不留行、山药、何首乌、益母草、山楂、泽泻、菟丝子、蛇床子、漏芦、白芍、乌药和黄芪等, 以我国中医药传统的炮制方法为基础, 采用发酵工艺与现代微纳米技术及工艺, 将其制成3~5 μ m直径颗粒的复合中草药制剂。

根据奶牛的产奶量和泌乳时间相近的原则选取20头健康的泌乳中后期中国荷斯坦奶牛, 随机均分成A、B、C和D 4组, 每组5个重复, 每个重复1头牛。A组为对照组, 饲喂基础日粮; B、C和D组分别在每头牛的基础日粮中添加50、100和150 g/d水平的中草药制剂, 预饲7 d, 正式试验期33 d。分组及处理见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验分组及处理 Table 1 Experimental grouping and treatments 组别 Groups 日产奶量 Day milk yield (kg) 泌乳天数 Days in milk (d) 中草药添加量 Chinese herbal medicine addition (g) A 15.32± 1.05 202 0 B 15.64± 0.87 204 50 C 15.68± 1.23 199 100 D 15.38± 0.94 203 150

表1 试验分组及处理 Table 1 Experimental grouping and treatments

奶牛基础日粮及饲喂量主要为青贮玉米秸秆15 g/d、 矮象草10 kg/d、 啤酒糟8 kg/d及配合精料4 kg/d, 精料参照《奶牛营养需要》(第7版)^[21]配制, 配方及营养成分见表2。试验奶牛集中在一栋栏舍饲养, 统一管理。试验期间每天分别在5:30和15:00喂料, 6:00和17:30挤奶, 自由饮水, 夜间运动场放牧。中草药添加剂在喂料时添加至精料中, 搅拌均匀; 预试期前3 d添加量为正式期的1/3, 后4 d为2/3。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 配方及营养成分 Table 2 Feed formula and nutrient component 原料 Feedstuff 比例 Composition (%) 营养水平 Nutrient levels 数值 Value 玉米 Corn 52.00 干物质 Dry matter (%) 86.98 小麦麸 Wheat bran 12.00 粗蛋白 Crude protein (%) 18.97 豆粕 Soybean meal 10.00 净能 Net energy (MJ/kg) 7.09 棉粕 Cottonseed meal 14.00 中性洗涤纤维Neutral 18.01 菜粕 Rapeseed meal 5.00 detergent fiber (%) 贝壳粉 Shell meal 1.60 酸性洗涤纤维 Acid 8.45 食盐 Salt 1.00 detergent fiber (%) 磷酸氢钙 CaHPO4 1.40 钙 Ca (%) 0.95 小苏打 NaHCO3 2.00 磷 P (%) 0.62 预混料 Premix 1.00 合计 Total 100.00 注:每kg预混料含有 Contained the following per kg of the premix: VA≥ 1500000 IU, VD3≥ 300000 IU, VE≥ 1800000 IU, 烟酸 Nicotinic acid≥ 2500 mg, Cu≥ 1500 mg, Fe≥ 5600 mg, Mn≥ 4500 mg, Zn≥ 9600 mg, I≥ 150 mg, Se≥ 40 mg, Co≥ 60 mg. 营养水平为计算值 Nutrient levels were calculated values.

表2 配方及营养成分 Table 2 Feed formula and nutrient component

在牛舍内两侧牛床上方距地面1.5 m 高处悬挂温湿度计, 试验期间每天于5:30和14:00记录温度和相对湿度, 并计算温湿指数。采用全封闭鱼骨式挤奶厅系统流量计记录每头牛每天的产奶量; 试验结束时, 按6∶ 4比例收集早、晚两次奶样, 混合后用于测定乳脂率、乳蛋白率、体细胞数, 在上海奶牛生产测定中心实验室用全自动乳成分仪(丹麦, FOSS)测定。

在试验期的第1, 20和40天分别从供试奶牛的颈静脉采血。每头牛每次采血约为40 mL, 分装成4管(每管10 mL), 用肝素钠抗凝全血, 其中2管马上用牛淋巴细胞分离液(北京索莱宝公司)分离淋巴细胞, 用冻存液悬浮后放入液氮保存。

1.7.1 引物设计及合成 基因表达分析采用荧光定量RT-PCR法, 根据网上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)发表的基因序列, 以Beta-actin mRNA作内参, 根据GenBank中奶牛的GSH-Px、CAT、Bcl-2、p53和Beta-actin的基因登陆序列(依次为NM001035386、NM174077、BTU92434、BC102440.1和BC142413), 用Primer Premier 5.0软件设计引物(表3)。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 GSH-Px、CAT、Bcl-2、p53和Beta-actin基因的引物设计 Table 3 Primer design for GSH-Px, CAT, Bcl-2, p53 and Beta-actin 扩增 基因 Gene 引物序列 Primer sequence (5'-3') 产物 Product (bp) GSH-Px 上游 Upperstream: AGGAAAACGCCAAGAACGAGGAG 213 下游 Downstream: GGGGACCAGGTGATGAACTTAG CAT 上游 Upperstream: GGCCTCCGCGATCTTTTCAATG 392 下游 Downstream: GGGCCGTCACGCTGGTAGTTG Bcl-2 上游 Upperstream: GATGACCGAGTACCTGAACC 122 下游 Downstream: GAGACAGCCAGGAGAAATCA p53 上游 Upperstream: CTTTGAGGTGCGTGTTT 118 下游 Downstream: CAGTGCTCGCTTAGTGC β -actin: 上游 Upperstream: TCCAGCCTTCCTTCCTGGGCAT 116 下游 Downstream: GGACAGCACCGTGTTGGCGTAGA

表3 GSH-Px、CAT、Bcl-2、p53和Beta-actin基因的引物设计 Table 3 Primer design for GSH-Px, CAT, Bcl-2, p53 and Beta-actin

1.7.2 血液总RNA及淋巴细胞RNA的提取 血液淋巴细胞用北京索莱宝科技有限公司生产的淋巴细胞分离液进行提取; 总RNA的提取采用日本基因株式会社的ISOGEN-LS总RNA抽提试剂盒, 并按其说明书操作。所有过程均在无菌操作台上进行。

1.7.3 反转录cDNA 采用RevertAidTM First Strand cDNA Systhesis Kit反转录试剂盒, 按试剂盒说明书操作。

1.7.4 cDNA的RT-PCR反应体系 GSH-Px、CAT、Bcl-2和p53的荧光定量RT-PCR反应体系各成分及加样量见表4。反应条件为:95℃预变性1 min, 进行如下循环:95℃15 s, 60℃15 s, 72℃45 s; 35个循环后, 72℃延伸7 min, 4℃保存。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 RT-PCR反应体系各成分及加样量 Table 4 Ingredients and adding-sample amount of RT-PCR reaction system 成分 Ingredient 加样量Adding- sample amount (μ L) cDNA 5.0 SYBR Green Realtime PCR Master Mix 25.0 β -actin上游引物Upperstream primer (10 pmol/μ L) 1.0 β -actin下游引物Downstream primer (10 pmol/μ L) 1.0 灭菌蒸馏水Distilled water 18.0 总反应体积Cubage of the reaction system 50.0

表4 RT-PCR反应体系各成分及加样量 Table 4 Ingredients and adding-sample amount of RT-PCR reaction system

1.7.5 RT-PCR产物的检测与相对定量 所得产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带, 条件为:90 V, 60 min, 凝胶电泳成像系统成像, 以50 bp Marker作对照检验目标条带大小是否与β -actin产物大小相同。本试验中将cDNA样品进行1, 5, 25, 125, 625, 3125倍稀释, 对目的基因和内参基因进行PCR扩增, 以cDNA稀释倍数取对数值为横坐标, △ Ct值为纵坐标作图, 得到回归线Y=0.0629X+6.058, R²=0.55, 曲线斜率为0.0629, 说明目的基因和内参基因扩增效率基本一致, 可以用2^{-△ △ Ct}法计算本试验中基因相对表达量, 即以对照组基因表达量为1倍, 处理组表达量为相对于对照组的表达倍数。

将冻存的细胞放入水浴锅(37℃)迅速解冻, 1500 r/min离心10 min, 吸除上清, 加入1 mL冰浴预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)重悬细胞并转移至1.5 mL离心管, 再次离心并吸除上清, 加入1 mL冰浴预冷的70%浓度的乙醇, 反复吹打以避免细胞成团, 固定24 h后离心并弃去上清, 加入1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞, 再次离心并吸除上清, 加入0.5 mL碘化丙啶染色液(碧云天生物技术研究所)37℃避光孵育30 min后上流式细胞仪(Beckman Coulter, EPICS XL/-MCL)检测。

数据用Excel进行初步处理后, 再使用SPSS 17.0统计软件进行成对样本差异显著性检验, 结果用平均值± 标准误表示, 检验误差为5%和1%水平。

由表5可知, 不同剂量复合中草药制剂的添加对于维持奶牛的产奶量具有明显的效果, 虽然整体产奶量均较试验开始前有所下降, 但3个试验组奶牛的产奶量分别比对照组高出20.26%(P< 0.05), 24.20%(P< 0.05)和16.98%(P> 0.05), 其中, B、C 组达到显著水平; 复合中草药制剂对乳脂率和乳蛋白率的影响不显著(P> 0.05), 但对乳中体细胞数影响显著, B、C和D组分别较对照组降低了21.68%(P< 0.05), 29.88%(P< 0.05)和24.22%(P< 0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 复合中草药制剂对奶牛产奶性能的影响 Table 5 Effect of compound Chinese herbal medicine on milk performance of dairy cattle 组别 Groups 产奶量 Milk yield (kg) 乳脂率 Milk fat percentage (%) 乳蛋白率 Milk protein content (%) 体细胞数 Somatic number (× 105) A 10.66± 0.75 b 3.61± 0.24 3.27± 0.20 5.12± 0.33 a B 12.82± 0.60 a 3.49± 0.14 3.26± 0.17 4.01± 0.25 b C 13.24± 0.69 a 3.32± 0.18 3.50± 0.18 3.59± 0.36 b D 12.47± 0.59 ab 3.79± 0.16 3.13± 0.09 3.88± 0.41 b Note: There are significant differences between figures in the same column with different lower-case letters (P< 0.05) and capital letters(P< 0.01) respectively. The same below. 注:同列大写字母不同者表示差异极显著(P< 0.01), 小写字母不同者表示差异显著(P< 0.05), 下同。

表5 复合中草药制剂对奶牛产奶性能的影响 Table 5 Effect of compound Chinese herbal medicine on milk performance of dairy cattle

由表6可知, 在添加复合中草药制剂之前, 各组奶牛血液GSH-Px基因的表达水平之间不存在显著差异, 添加了复合中草药制剂之后, 各试验组奶牛血液GSH-Px基因的表达水平均呈现出上升的趋势, 3个试验组在第20和40天时的表达水平较对照组分别高出6.00%(P> 0.05), 15.00%(P> 0.05), 4.00%(P> 0.05)和10.00%(P> 0.05), 22.00%(P< 0.05), 10.00%(P> 0.05), 其中C组在第40天时的涨幅达到显著水平; 从整个试验期的平均水平来看, 3个试验组比对照组分别高出5.00%(P> 0.05), 13.00%(P< 0.05)和6.00%(P> 0.05), C组达到显著水平。说明复合中草药制剂能有效提高热应激奶牛血液抗氧化酶GSH-Px基因的表达水平。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 复合中草药制剂对奶牛GSH-Px和CAT基因表达水平的影响 Table 6 Effects of compound Chinese herbal medicine on GSH-Px and CAT gene expression levels of dairy cattle 基因 Gene 组别 Groups 时间 Time (d) 平均 Mean 1 20 40 GSH- Px A 1.00 1.00 1.00 b 1.00 b B 0.98± 0.07 1.06± 0.04 1.10± 0.09 ab 1.05± 0.04 ab C 1.02± 0.06 1.15± 0.08 1.22± 0.07 a 1.13± 0.06 a D 1.03± 0.05 1.04± 0.07 1.10± 0.07 ab 1.06± 0.02 ab CAT A 1.00 1.00 1.00b 1.00 b B 0.99± 0.05 1.08± 0.10 1.09± 0.09 ab 1.05± 0.03 ab C 1.02± 0.06 1.20± 0.10 1.26± 0.07 a 1.16± 0.07 a D 0.99± 0.06 1.04± 0.09 1.06± 0.10 ab 1.03± 0.02 ab

表6 复合中草药制剂对奶牛GSH-Px和CAT基因表达水平的影响 Table 6 Effects of compound Chinese herbal medicine on GSH-Px and CAT gene expression levels of dairy cattle

各组奶牛血液CAT基因的表达水平在添加复合中草药制剂前不存在显著差异(表6)。在试验的第20和40 天, 3个试验组奶牛血液CAT基因的表达水平较对照组分别升高了8.00%(P> 0.05), 20.00%(P> 0.05), 4.00%(P> 0.05)和9.00%(P> 0.05), 26.00%(P< 0.05), 6.00%(P> 0.05), 其中, C组在第40天时及全期的增幅达到显著水平。从全期的平均水平来看, 3个试验组的涨幅分别达到5.00%(P> 0.05), 16.00%(P< 0.05)和3.00%(P> 0.05), C组与对照组之间存在显著差异。说明复合中草药制剂在提高热应激奶牛血液抗氧化酶CAT基因的表达水平方面具有明显的效果。

由表7可知, 各组奶牛血淋巴细胞凋亡率在试验开始之前不存在显著差异, 添加复合中草药制剂之后, B、C 组奶牛在第20天时的血淋巴细胞凋亡率较对照组显著降低, 降幅分别达到21.01%(P< 0.05)和23.64%(P< 0.05), 到第40天时, 3个试验组奶牛的血淋巴细胞凋亡率较对照组分别降低了27.45%(P< 0.01), 27.36%(P< 0.01)和24.55%(P< 0.01), 均达到极显著水平; 就整个试验期而言, 3个试验组奶牛的血淋巴细胞凋亡率较对照组分别降低了18.20%(P> 0.05), 17.86%(P> 0.05)和12.51%(P> 0.05)。该结果表明复合中草药制剂能有效降低热应激奶牛外周血淋巴细胞的凋亡率。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 复合中草药制剂对奶牛淋巴细胞凋亡率的影响 Table 7 Effects of compound Chinese herbal medicine on apoptosis rate of lymphocytes in peripheral blood of dairy cattle 基因 Gene 时间 Time (d) 平均 Mean 1 20 40 A 5.09± 0.34 10.28± 0.64 a 11.00± 0.65 A 8.79± 1.86 B 5.48± 0.43 8.12± 0.72 b 7.98± 0.71 B 7.19± 0.86 C 5.82± 0.68 7.85± 0.54 b 7.99± 0.46 B 7.22± 0.70 D 5.36± 0.53 9.42± 0.47 ab 8.30± 0.66 B 7.69± 1.21

表7 复合中草药制剂对奶牛淋巴细胞凋亡率的影响 Table 7 Effects of compound Chinese herbal medicine on apoptosis rate of lymphocytes in peripheral blood of dairy cattle

各组奶牛血淋巴细胞Bcl-2基因表达水平在试验开始之前不存在显著差异(表8)。添加复合中草药制剂后, 3个试验组奶牛血淋巴细胞Bcl-2基因的表达水平较对照组相比均有不同程度的降低, 其中, B、C组在第20及3个试验组在第40天时的增幅均达到极显著水平(P< 0.01), D组在第20天时的增幅也达到显著水平(P< 0.05), 从整个试验期的平均水平来看, B、C和D组较对照组的增幅分别达到105.00%(P< 0.01), 113.00%(P< 0.01)和57.00%(P> 0.05)。结果说明复合中草药制剂对热应激奶牛血淋巴细胞Bcl-2基因表达水平的影响非常显著。

表8

Table 8

表8(Table 8)

表8 复合中草药制剂对奶牛Bcl-2和p53基因表达水平的影响 Table 8 Effects of compound Chinese herbal medicine on Bcl-2 and p53 gene expression levels of dairy cattle 基因 Gene 组别 Groups 时间 Time (d) 平均 Mean 1 20 40 Bcl-2 A 1.00 1.00 bBC 1.00 B 1.00 B B 0.95± 0.06 2.71± 0.24 A 2.48± 0.20 A 2.05± 0.55 A C 0.96± 0.07 2.82± 0.28 A 2.62± 0.24 aA 2.13± 0.59 A D 1.03± 0.10 1.72± 0.19 aB 1.96± 0.22 bA 1.57± 0.28 AB p53 A 1.00 1.00 A 1.00 bA 1.00 B 1.03± 0.11 0.61± 0.05 B 0.64± 0.08 B 0.76± 0.14 C 1.04± 0.11 0.57± 0.08 B 0.56± 0.10 B 0.72± 0.16 D 0.96± 0.12 0.74± 0.05 B 0.70± 0.06 B 0.80± 0.08

表8 复合中草药制剂对奶牛Bcl-2和p53基因表达水平的影响 Table 8 Effects of compound Chinese herbal medicine on Bcl-2 and p53 gene expression levels of dairy cattle

各组奶牛血淋巴细胞p53基因的表达水平在添加复合中草药制剂之前不存在显著差异。试验开始之后, B、C和D组在第20和40天时较对照组的降幅均达到极显著水平(P< 0.01), 就整个试验期的平均水平来看, 3个试验组较对照组分别降低了24.00%(P> 0.05), 28.00%(P> 0.05)和20.00%(P> 0.05)。说明复合中草药制剂的添加能有效降低热应激奶牛血淋巴细胞p53基因的表达水平。

奶牛受热应激的影响, 直肠温度、呼吸频率和脉搏等3项生理常数指标均会显著升高, 这直接影响到奶牛的采食量, 并最终导致产奶量的显著下降^[22]。在本研究中, 测定的牛舍温湿指数在整个试验期一直大于72, 说明奶牛一直处于热应激状态, 各组奶牛的产奶量较试验开始前也出现了不同程度的降低, 其中, 对照组的降幅达到30.42%, 而复合中草药制剂的添加对维持奶牛的产奶量表现出一定的效果, 3个试验组奶牛的产奶量较对照组分别高出了20.26%、24.20%和16.98%, 这可能是由于复合中草药制剂对奶牛热应激有较好的缓解作用^[23], 能有效清除热应激产生的过量自由基^[24], 增强奶牛机体抗氧化功能, 进而提高采食量, 改善奶牛的产奶性能。其中, B、C组的乳蛋白率和B、D组的乳脂率较对照组有所降低, 但由于日产奶量的提高幅度较大, 因此, 总的乳脂产量和乳蛋白产量仍然较对照组有明显的升高; 但D组的乳脂率和C组的乳蛋白率又较对照组有所提高, 这可能是因为奶牛个体之间的差异以及奶牛在热应激条件下自行选择采食的日粮结构组成存在差异, 比如青饲料和精料的比例不同。另外, 3个试验组奶牛乳中体细胞数较对照组分别降低了21.68%、29.88%和24.22%, 说明复合中草药制剂能对热应激奶牛起到一定的保健作用, 增强机体的免疫能力, 抑制炎症的发生。

基于抗氧化酶GSH-Px和CAT对机体抗氧化应激的重要性, 本研究探索了复合中草药制剂对热应激奶牛血液GSH-Px和CAT基因表达的影响。GSH-Px、SOD和CAT一起构成了生物体内活性氧防御系统, 机体对活性氧 O2-的第1道防线是SOD, 它将 O2-转化为过氧化氢和其他氢过氧化物; 第2道防线是CAT和GSH-Px, 其中CAT可清除过氧体系中的H₂O₂, 而GSH-Px分布在细胞的胞液和线粒体中, 可同时清除H₂O₂和氢过氧化物, 从而有效地保护机体^[25]。前人的研究表明, 自由基数量的减少等能增强GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶基因的表达水平, 进而阻断脂质过氧化链式反应, 缓解膜脂质过氧化, 提高机体抗氧化应激能力并减少细胞的损伤^[26]。在本研究中, 复合中草药制剂的添加显著提高了热应激奶牛血液GSH-Px和CAT基因的表达水平, 说明奶牛的抗氧化能力得到了显著提高。这是由于复合中草药制剂中富含黄酮类、多酚类和鞣质类化合物, 黄酮类物质能通过酚羟基与自由基生成稳定的半醒自由基, 通过抗氧化剂的还原作用直接给出电子而清除自由基; 多酚类化合物是极好的氢或电子供体, 结构稳定, 不会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化, 所以有很好的抗氧化效果; 而鞣质类物质的抗氧化性主要体现在其通过还原反应降低环境中氧含量, 或作为氢供体与环境中自由基结合, 终止自由基引发的连锁反应^[24]。复合中草药制剂中的抗氧化类化合物共同作用, 促进过量自由基的清除, 提高抗氧化酶基因的表达水平, 并最终改善奶牛机体的抗氧化能力。

有研究表明, 热应激能显著增加奶牛^{[27, 28]}和藏獒^[29]外周血淋巴细胞的凋亡率, 但在热应激初期奶牛具有一定的自身调节能力来减弱热应激反应^[30]。在本研究中, 试验期的奶牛一直处于热应激状态下, 热应激对奶牛淋巴细胞造成了极大的损伤, 对照组奶牛在试验第20和40天时的淋巴细胞凋亡率分别比试验开始前升高了101.96%和116.11%, 3个试验组奶牛的淋巴细胞凋亡率也较试验开始前有所升高, 但复合中草药制剂的添加对于降低淋巴细胞的损伤还是表现出了显著的效果, 凋亡率的平均水平较对照组分别降低了18.20%, 17.86%和12.51%。Bcl-2是动物机体内重要的抗凋亡基因, 能够有效延长细胞周期^[31]; p53调控一些仅有BH3区域的蛋白, 诱导细胞凋亡的功能十分显著^{[32, 33]}。p53作为促细胞凋亡因子, 其高表达能减少Bcl-2的表达, 促进细胞凋亡; 而Bcl-2又能抑制p53介导的细胞凋亡。当p53基因失活时, 引起Bcl-2家族基因调控失衡, 凋亡抑制基因Bcl-2 的表达水平升高, 导致靶细胞不易诱发细胞凋亡^[34], 因而p53与Bcl-2家族基因的调控作用是相互联系的。在本研究中, 复合中草药制剂的添加有效地降低了p53基因的表达并增加了Bcl-2基因的表达, 因此, 能有效的降低淋巴细胞的凋亡率, 增强奶牛机体的细胞免疫和体液免疫能力, 并最终减轻热应激对奶牛机体造成的损伤。

在本研究中, 综合考虑各指标, 给每头牛添加100 g/d水平复合中草药制剂的效果要好于50和150 g/d水平。总结其原因, 100 g/d添加水平效果要优于50 g/d添加水平的原因可能是因为50 g/d的添加剂量还略为偏低, 虽然也有比较明显的效果, 但还是赶不上100 g/d添加水平的效果; 而150 g/d添加水平的效果不如100 g/d添加水平的原因可能是由于中草药添加剂有一定的苦味, 在炎热的天气条件下, 较高剂量的摄入对奶牛会产生味觉上的刺激, 会使奶牛机体产生一定程度的应激, 尽管如此, 它起到的正向功效还是不容忽视的。从实际使用效果及经济收益方面来考虑, 每头牛100 g/d的添加水平最为适宜。