不同营养调控对草地早熟禾生长和内源激素含量影响研究
刘强1,4, 张锁科1,2, 孙万斌1,3, 俞玲1,2, 马晖玲1,2,3*,*
1.甘肃农业大学草业学院,甘肃 兰州730070
2.草业生态系统教育部重点实验室,甘肃 兰州730070
3.中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州730070
4.甘肃省农垦农业研究院,甘肃 武威733006
*通讯作者 Corresponding author. E-mail:mahl@gsau.edu.cn

作者简介:刘强(1971-),男,甘肃天水人,研究员,在读博士。E-mail:944614087@qq.com

摘要

养分在促进草坪生长中发挥着重要的作用。为了探讨不同肥料在草地早熟禾生长中的作用机理,采用不同的施肥组合进行草地早熟禾草坪的建植试验,研究了不同养分调控下草地早熟禾生长发育状况与内源激素含量水平的相关性,并对草地早熟禾坪用质量状况进行了评价。研究结果表明,在配合施用一定量生物菌肥和柠檬酸的情况下,较少量的氮、磷肥施用(处理3)能显著提高草地早熟禾坪用质量;各施肥组合能显著促进植株体IAA和ZT含量的提高,抑制ABA含量在根部的合成和体内的积累;在施肥后的35 d内,IAA和ZT含量随着施肥后时间的推移而不断增加,而ABA含量在除对照以外的各处理中相对较低,且随着施肥后时间的推移,其含量也明显下降,但在对照处理中却表现出一定的增加态势。

关键词: 营养调控; 草地早熟禾; 内源激素; 生长; 生物菌肥; 柠檬酸
Nutrition effects on growth and endogenous hormones in kentucky bluegrass
LIU Qiang1,4, ZHANG Suoke1,2, SUN Wanbin1,3, YU Ling1,2, MA Huiling1,2,3,*
1.College of Pratacultural, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
2.Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education, Lanzhou 730070, China
3.Sino-U.S. Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China
4.Gansu State Farms Academy of Agricultural Research, Wuwei 733006, China
Abstract

Nutrient application is essential in turf management. To help reveal the mechanisms of fertilizer improvement in turfgrass growth, field experiments were carried out testing different fertilizer combinations. The relationship between endogenous hormone content and growth of kentucky bluegrass ( Poa pratensis) was determined; turf quality was also evaluated. Fertilizer application (bio-fertilizer and citric acid) significantly affected turf quality. Fertilization significantly improved indoleacetic acid (IAA) and zeatin (ZT) content and restricted the synthesis and accumulation of abscisic acid (ABA).Post fertilization, IAA and ZT content increased with time (35 days). However, ABA content was relatively low and decreased after fertilizer application.

Keyword: nutrient control; kentucky bluegrass (Poa pratensis); endogenous hormone; growth; bio-fertilizer; citric acid

草坪是现代人类生活环境与文明的重要组成部分, 在城市生态系统中扮演着重要的角色, 具有保持水土、改造自然、美化环境等多种作用[1], 对人类赖以生存的环境起美化、保护和改善的作用[2], 并能提供人们休闲、娱乐和适度体育运动场所[3]。冷季型草坪草— — 草地早熟禾(Poa pratensis)作为北方主要草坪草品种, 因质地纤细、再生能力和耐修剪性强、绿期长、坪质优美, 具有较强的抗寒能力等优良特性, 被广泛应用于草坪建植和园林绿化。

大量研究结果表明, 植物内源激素能影响谷粒的建成、库潜力以及同化物的运输和积累[4, 5, 6]。如吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)具有代替种子库的作用, 发育的草莓(Fragaria ananassa)果实中的溶流质受种子中产生的IAA调控[7]。同类的反应在菜豆(Radermachera sinica)中也得到了证明。植物激素具有促进菜豆果实中32P库的作用[8], 小麦(Triticum aestivum)体内IAA的含量水平决定着小麦不同穗位积累的干物质存在差异[9]。内源脱落酸(abscisic acid, ABA)与植株的气孔开闭有关[10], 诱导气孔关闭或抵制气孔开放, 降低植株的蒸腾失水。ABA作为根冠间的信号物质, 既会在干旱胁迫情况下出现, 也会在土壤养分胁迫或盐分胁迫时出现[11]。而细胞分裂素ZT(zeatin)在促进细胞分裂、促进侧芽发育、延缓叶片衰老等多方面发挥作用。

由于土壤对磷的固定吸附作用, 施入土壤中的大量有效磷被转化为难以被作物吸收利用的形态, 在土壤中储存起来, 致使磷肥的当季利用率一般只有10%~25%[12]。如何降低土壤对磷的固定吸附, 提高磷素的有效性一直是农业科研人员关心的课题[13]。柠檬酸对土壤难溶性磷的活化作用已是不争的事实, 与生物菌肥配合施用能有效提高草坪质量[14]。基于柠檬酸对土壤磷的活化作用, 本研究采用柠檬酸作为营养调控的辅助性肥料。有关不同施肥处理对草坪生长指标影响的报道较多[15, 16, 17, 18, 19, 20], 但探讨不同肥料种类处理下草坪植株体内源激素水平的变化动态及其生长响应的报道很少。本研究以草地早熟禾品种“ 午夜2号” (P. pratensis cv. Midnight II)的根、茎、叶为供试材料, 就不同肥料种类处理下草坪坪用质量、根系生长发育指标以及3种内源激素(脱落酸ABA、生长素IAA和细胞分裂素ZT)含量进行了测定, 从草地早熟禾地上部分生长状况、根系发育情况以及激素水平3个层面审视和比较不同施肥处理的差异性, 分析不同肥料处理下内源激素水平与其生长发育状况的相关性, 并以上述研究结果为依据, 选出最优施肥组合, 以期为草坪的养分管理提供参考依据和理论指导。

1 材料与方法
1.1 材料

草地早熟禾品种“ 午夜2号” 由北京克劳沃公司提供; 促生菌肥由甘肃农业大学草业学院提供, 该菌肥含有从不同禾本科植物根际分离筛选的高效溶磷菌株、联合固氮菌株、分泌植物激素菌株和生防菌株, 通过菌株间拮抗、互作特性、溶磷、固氮、分泌植物生长激素及耐盐性、拮抗病原菌等指标测定研发的可有效促进植物生长和防治根部病害的复合液体肥料, 专利号ZL 2010 1 0557699.3; 柠檬酸, 西安化学试剂厂生产的分析纯化学试剂; 氮、磷肥, 甘肃刘化(集团)有限责任公司生产的尿素(总N≥ 46.4%)和甘肃金昌化学工业集团有限公司生产的磷酸二铵(N≥ 18%, P2O5≥ 46%), 按养分含量和各处理氮、磷用量计算两种肥料用量。

1.2 试验区基本情况

试验设在甘肃农业大学草坪草种质资源圃内, 海拔1520 m, 年平均降雨量324.5 mm。试验地土壤pH 8.35, 水溶性盐0.65 g/kg, 有机质含量14.42 g/kg, 水解氮38.9 mg/kg, 速效磷7.8 mg/kg, 速效钾115 mg/kg。

1.3 试验设计

试验设对照和施肥处理, 施肥处理包括氮(N1、N2两个水平, 其中N1为当地草坪施氮量的50%, N2为当地草坪施氮量)、磷(P1、P2两个水平, 其中P1为当地草坪施磷量的50%, P2为当地草坪施磷量)、菌肥(J1、J2两个水平, 其中J1为推荐用量的50%, J2为推荐用量)、柠檬酸(C1、C2两个水平, C1为15 kg/hm2, C2为45 kg/hm2), 所有肥料用量为全年施肥量。共8个处理, 具体肥料组合处理见表1。小区面积1.5 m2, 所有试验小区间采用深度为20 cm的塑料薄膜进行隔离。播种量为25 g/m2, 试验设3次重复, 随机区组排列。

具体施肥方法:第1次施肥于2011年9月试验草坪建植时进行, 每小区所有肥料在建植草坪时一次性基施。2012年4月进行第2次施肥, 按试验处理施肥量均匀施入小区后进行喷水灌溉。并于施肥后第5, 10, 15, 25和35天取草地早熟禾根、茎、叶带回实验室进行内源激素的测定, 地上部分相关指标和根系活力在施肥后第15天进行。

1.4 试验方法

1.4.1 草地早熟禾地上部相关指标的测定 草坪密度:枝条计数方法测定[21]; 草坪质地:叶片宽度测量法测定[22]; 草坪颜色(叶绿素含量):分光光度计法测定[23]; 草坪盖度:针刺法测定[24]; 草坪高度:测量尺测定。

表1 田间试验不同施肥处理 Table 1 Treatments of different fertilizer application

1.4.2 草地早熟禾根生长指标的测定 根长:刻度尺测定; 根冠比:称重法测定[25]; 根体积:排水法测定[26]; 根系活力:氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定[27]

1.4.3 内源激素的测定 高效液相色谱法(HPLC)测定[28, 29, 30]。其色谱条件为:ODS-C18(250.0 mm× 4.6 mm)色谱柱; 柱温30℃; 流动相:甲醇-乙酸-水(50∶ 5∶ 45, 体积比); pH值3.2; 流速1.0 mL/min; 检测波长:UVZT为254 nm, UVIAA, ABA为210 nm。

1.5 数据处理

采用DPS 7.05、Excel和Sigma Plot统计分析软件。

2 结果与分析
2.1 不同养分调控对草地早熟禾地上部分生长的影响

有研究表明, 当施氮量为30~120 kg/hm2时, 草坪植物可接受的草坪质量持续时间为13~48 d[31], 而施肥20 d后草地早熟禾色泽开始下降。为此, 本研究选择施肥后第15天测定各生长指标。

表2 草地早熟禾外观质量 Table 2 The appearance quality of kentucky bluegrass

从测定结果(表2)看, 在不同施肥处理下, 草地早熟禾盖度、高度、密度、质地、颜色差异显著, 且均明显优于对照。其中盖度比对照增加16.5%~21.6%, 高度增加7.5%~62.6%, 质地减小10.0%~18.7%, 密度增加7.5%~30.1%, 叶绿素增加9.0%~58.2%。综合分析各外观指标, 在处理3下, 草坪盖度、高度均达最大值, 分别为96.89%和21.37 cm, 草坪颜色最深, 叶绿素含量为2.99 mg/kg, 叶片质地最好(叶宽仅为2.00 mm), 密度达到最大(121.00株/m2), 显著高于其他个别处理和CK。在其他各处理中, 其盖度、高度、密度、叶绿素含量较CK均明显提高, 坪用质量明显优于CK。

2.2 不同养分调控对草地早熟禾根系生长的影响

施肥后第15天对各处理的草地早熟禾根系进行研究, 结果表明(表3), 在各施肥处理下, 其根长、根冠比、根体积、根系活力差异明显, 均优于CK, 其中根长增加最大达到51.1%, 根冠比最大增加达75.6%, 根系活力最大增加了29.1%, 而根体积最大增加了1倍以上。在处理3下, 草地早熟禾根长、根系活力和根体积达到最大, 分别为5.21 cm、199.73 mg/(kg· h)和0.0453 cm3, 根冠比最小(2.56)。处理3的草地早熟禾根长显著高于其他处理。

表3 不同营养处理对草地早熟禾根系的影响 Table 3 Effect of different nutrients treatments on roots of kentucky bluegrass
2.3 不同养分调控对草地早熟禾各器官中内源激素含量及变化动态的影响

2.3.1 不同处理及处理后持续时间对各器官内源激素IAA含量的影响 试验结果表明(表4), 草地早熟禾内源IAA在体内含量与不同的肥料施用关系密切。在对照中, 内源IAA含量水平较低, 且随着时间的推移, 其含量水平呈现递减趋势, 说明在低养分胁迫下, IAA在体内的合成和运输受到了一定的限制; 同一施肥处理下, 草地早熟禾在同一时期的IAA含量在各器官的分布呈现差异性, 在施肥后的第10~35天内, IAA在各器官中的含量都极显著高于对照。在含量变化趋于稳定后的第35天, T3的根部、茎和叶片IAA含量最高, 分别达到了239.14, 236.45和297.85 mg/kg, 而对照中仅分别为13.90, 13.91和18.87 mg/kg。且在施肥后的各个时期, 根和叶片中IAA含量均显著高于其他各处理。这可能是因为根和叶是IAA的合成或储存部位, 其含量要高于茎中的含量。

表4 不同施肥处理下草地早熟禾在不同时期不同器官中IAA含量 Table 4 IAA contents of kentucky bluegrass in different organ and different period under different treatment mg/kg

在草地早熟禾各器官中, 内源IAA含量随时间的变化而呈现规律性变化。在施肥后的35 d内, 草地早熟禾根、茎、叶中的IAA含量随着施肥后时间持续而迅速增加, 在进入施肥后第10天后, 早熟禾体内的IAA含量快速增长, 各处理根、茎和叶中IAA含量与对照相比呈现极显著增长态势。在第25天后, 上升趋势减缓, 说明内源IAA对肥料的响应在施肥后25 d内。在进入第25天后, 其含量变化趋于稳定, 维持在一个相对平稳的范围内。而在低养分胁迫下(CK), 草地早熟禾体内IAA含量在根、茎和叶中均表现出了递减趋势。

2.3.2 不同处理及处理后持续时间对各器官内源激素ABA含量的影响 内源ABA作为根冠间的信号物质, 能激发植物增强适应干旱和低温等多种环境胁迫的能力。它与植株的气孔开闭有关, 诱导气孔关闭或抵制气孔开放, 降低植株的蒸腾失水, 既会在干旱胁迫情况下出现, 也在土壤养分胁迫或盐分胁迫时出现。

表5 不同施肥处理下草地早熟禾在不同时期不同器官ABA的含量 Table 5 ABA contents of kentucky bluegrass in different organ and different period under different treatment mg/kg

草地早熟禾体内ABA含量随着施肥后时间的持续, 呈现出一定的变化规律。在同一处理下, 施肥后的第5天内ABA在各器官中的含量变化差异不大, 但在不同的处理中却存在着一定的差异(表5)。其中CK中ABA含量在根、茎和叶中都要高于其他各处理, 且与个别处理表现出显著或极显著的差异; 在施肥后的第5天, T5根中ABA含量与CK中基本相当, 达到103.7 mg/kg。但随着施肥后时间的持续, 在除对照以外的各处理中, 草地早熟禾根、茎和叶中ABA含量表现出明显的递减态势, 而在对照中, ABA含量随着施肥后时间的推移而持续上升, 且在进入10 d后, 根、茎和叶中的ABA含量大幅度高于其他各处理, 且达到极显著差异水平(P< 0.01)。在含量变化趋于稳定的第35天, 对照中ABA含量是其他各处理的4.1~6.8倍。

2.3.3 不同处理及处理后持续时间对各器官内源激素ZT含量的影响 各器官ZT含量随时间的变化与IAA的变化趋势基本一致(表6)。在同一肥料处理下各器官中ZT含量均随施肥时间的增长而增加, 施肥后第5到25天草地早熟禾各器官ZT含量上升趋势明显, 且在进入施肥后第10天, 其含量与CK间呈极显著增长, 但在第25天后, ZT含量上升趋势减弱, 趋于平稳。而在对照中, ZT在各器官中的含量变化不明显, 但随着施肥后时间的持续, 其含量在根、茎和叶中均没有表现出递增趋势, 相反, 却呈现出缓慢递减的态势。

表6 不同施肥处理下草地早熟禾不同时期和不同器官ZT含量 Table 6 ZT contents of kentucky bluegrass in different organ and different period under different treatment mg/kg

综上, 不同肥料处理下草地早熟禾根、茎和叶中ZT、IAA以及ABA含量随施肥时间的增长呈现一定的规律性变化。在同一肥料处理下各器官中ZT、IAA含量均随施肥时间的增长而增加, 但ABA含量随施肥时间的增长而减小; 施肥后第5到25天草地早熟禾各器官ZT、IAA含量上升趋势明显, ABA含量下降趋势明显。在施肥第25天后发现, ZT、IAA含量上升趋势减弱, ABA含量下降趋势减弱, 表明内源激素对肥料的响应一般在施肥后第5~25天之间, 在这一段时间内, ZT和IAA在各器官中的合成代谢明显加快。

2.3.4 不同施肥处理下草地早熟禾ZT/ABA和(ZT+IAA)/ABA变化 ZT/ABA和(ZT+IAA)/ABA的含量比值如图1图2所示。经分析, 草地早熟禾在同一肥料处理下同一器官的ZT/ABA和(ZT+IAA)/ABA均随施肥后时间的增长而增大, 在进入第25天后趋于平衡, 与ZT和IAA含量随施肥后时间的持续变化趋势基本一致。同一肥料处理、同一时期(ZT+IAA)/ABA在草地早熟禾各器官的分布基本呈现规律性, 具体表现为叶> 茎> 根, 而ZT/ABA在各器官的分布规律不明显。在处理3下草地早熟禾各器官ZT/ABA、(ZT+IAA)/ABA均明显高于其他处理。

图1 不同施肥处理下草地早熟禾ZT/ABA变化Fig.1 ZT/ABA changes in kentucky bluegrass under different treatments

图2 不同施肥处理下草地早熟禾(ZT+IAA)/ABA变化Fig.2 (ZT+IAA)/ABA changes in kentucky bluegrass under different treatments

ZT/ABA、(ZT+IAA)/ABA值的大小能反映草地早熟禾生长和休眠状况, 本研究中ZT/ABA、(ZT+IAA)/ABA值均随施肥后时间的增长而增大, 这表明施肥后草地早熟禾生长状况良好。3 讨论柠檬酸和生物菌肥联合施用, 能显著提高土壤有效磷含量, 增加土壤中微生物数量, 提高土壤蔗糖酶和脲酶活性[14], 对促进草坪生长, 提高草坪质量发挥作用。本研究中包括柠檬酸和生物菌肥在内的不同肥料组合, 能影响草地早熟禾的生长和体内内源激素变化。

3.1 肥料对草坪质量的影响

合理施肥是保障草地早熟禾正常生长的重要途径, 有利于提高草地早熟禾坪用质量。作为观赏性草坪来讲, 衡量其质量好坏的主要因素是草坪色泽、密度、盖度与草坪质地。本研究结果表明, 施肥是改善草坪质量的一项极为有效的措施, 但不同肥料处理的影响效果各异。

草坪色泽是评价草坪质量的一个非常重要的因素。本试验结果表明, 不同肥料处理下草地早熟禾颜色差异明显。草地早熟禾的叶绿素含量在较低柠檬酸水平条件下均高于高水平柠檬酸条件, 由此可以初步认为在本研究中低水平的柠檬酸是促进草地早熟禾色泽提高的主要因子。草地早熟禾的密度在高菌肥水平条件下均高于低水平菌肥条件, 说明高水平的菌肥是促进草地早熟禾分蘖的主要因子, 而许多学者研究结果表明, 高水平的氮肥有利于促进草坪的分蘖[32], 但本研究中高水平的氮肥并没有提高草坪的密度。草坪质地是指草地早熟禾的纤细程度, 柠檬酸和菌肥施用量对草地早熟禾质地影响不明显。当菌肥、柠檬酸一定时, 低水平的N、P使草地早熟禾叶片纤细, 这样可以提高草地早熟禾的质地。盖度是指草地早熟禾对地面的覆盖程度, 本研究结果表明菌肥和氮肥对草地早熟禾盖度的影响不明显; 低水平的柠檬酸明显促进草地早熟禾盖度, 这可能与氮肥没有提高草地早熟禾分蘖能力有关。

施肥改善草坪质量的重要因素之一是改善了草地早熟禾生长的小生境。柠檬酸能够促进土壤中磷等营养元素从缓效态向有效态转化, 而生物菌肥靠有益菌的繁衍来活化土壤, 供给作物所需要的各种营养, 具有培肥地力、改良土壤、抗旱、促早熟的功效[33, 34, 35, 36]。本研究表明, 在不同施肥处理下, 草坪外观质量以及根系生长状况有所差异, 肥料处理均优于CK, 这与氮肥和磷肥对植物生长有良好的效应[37, 38, 39, 40]一致。氮、磷、柠檬酸以及菌肥的搭配能充分发挥各种养分的增产作用。

不同的氮磷肥料、菌肥和柠檬酸搭配对草地早熟禾外观质量以及根系生长水平具有显著影响, 在半常规氮磷肥+全菌肥+半柠檬酸配比下草地早熟禾外观质量及根系生长水平均优于CK及其他处理。这与当施肥量变动在0~800 kg/hm2时, 结缕草的种子产量以及地上、地下部的生长都与氮肥呈正相关, 总体趋势是中间水平的氮肥比高水平的氮肥好的结论一致[41]

3.2 不同肥料处理对植株体内源激素含量变化的影响

肥料影响草地早熟禾的生长发育, 据分析, 主要是通过影响其各部位内源激素水平的差异所致。不同肥料处理下草地早熟禾内源激素含量不同, 本研究表明草地早熟禾ZT、IAA含量在施肥后呈上升趋势, 而ABA呈下降趋势, 这与何萍和金继运的[42]研究结论相一致。氮钾配比可以增加IAA和GA3含量, 降低ABA含量, 这在郭英等[43]的研究中也得到了验证。激素水平的变化同样会引起草地早熟禾生长状态的变化, 如IAA抑制分蘖的发生, 去除或削弱IAA活性可以接触分蘖芽的休眠。GA和ABA也对禾本科植物分蘖起抑制作用。本研究表明低水平氮磷肥+低水平柠檬酸肥料搭配下草地早熟禾各器官IAA、ZT含量均大于高水平常规氮磷肥+高水平柠檬酸肥料搭配下的IAA、ZT含量, 而两个菌肥水平作用效果不明显。说明在氮磷肥与柠檬酸在低水平条件下, 高水平的菌肥有利于草地早熟禾IAA、ZT生成; 在低水平菌肥与低水平柠檬酸肥料搭配下ABA含量显著大于高水平菌肥与高水平柠檬酸处理中的含量。

3.3 不同肥料处理下内源激素水平与植株表型变化的相关性分析

植株体对某种营养元素摄入的多寡会影响植株体各器官激素的分配和含量的变化, 激素在各器官中的分布及其含量高低决定着器官形态的建成, 即表型的产生。李良勇和崔国贤[44]研究认为, 氮素营养减少, 降低了地上部和根系细胞分裂素的浓度, 从而降低相对生长率、根系呼吸。本研究结果与此一致。草地早熟禾在生长发育过程中对于营养元素的数量、浓度和比例有不同的要求, 不同施肥处理下草地早熟禾IAA、ZT、ABA含量与其地上生长状况以及根系生长状况有一定的相关性。本研究表明, 当草地早熟禾各器官ZT、IAA含量较高, ABA含量较低时, 草地早熟禾叶绿素含量较高, 密度、盖度增大, 根系活力旺盛, 根体积增大, 根冠比减小, 植株生长旺盛。反之, 草地早熟禾生长状况较差。植物体内磷的分配与积累规律总是随着作物生长中心的转移而转变。作物缺磷时, 磷分配至作物根系增多, 簇生根大量形成, 根冠比提高[45]。由此可见, 在不同施肥处理下, 草地早熟禾植株体表型变化与其内源激素水平的变化是相呼应的。

3.4 不同肥料搭配效果综合评价与草坪施肥指导

柠檬酸和菌肥配合普通化肥施用能显著提高了草地早熟禾IAA和ZT的产生, 明显抑制了ABA在植株体内合成与积累, 促进了根系生长, 改善了草地早熟禾色泽、提高了草地早熟禾坪用质量。本研究还表明, 150 L/hm2菌肥+10 kg/hm2柠檬酸+45 kg/hm2 N+30 kg/hm2 P2O5为最佳肥料搭配, 建议在草坪施肥管理中采用。4 结论施肥能显著增加草地早熟禾植株体内源激素IAA和ZT的含量, 抑制ABA含量合成与积累, 从而促进了草地早熟禾的生长发育; 草地早熟禾各器官中ZT、IAA含量为叶> 茎> 根, 而ABA含量为叶> 根> 茎; 在施肥后的35 d内, 随着施肥后时间的推移, 草地早熟禾中的内源激素IAA和ZT含量迅速上升并趋于平稳, 而ABA含量则呈下降态势, 但在不施肥(CK)的情况下, ABA含量上升趋势明显; 在配合施用生物菌肥和柠檬酸的情况下, 较低水平的氮、磷肥施用也能显著促进早地早熟禾的生长, 提高草坪质量, 说明施用生物菌肥和柠檬酸等辅助性肥料能通过改善土壤根际微生物环境、活化土壤中难溶性营养元素达到促进植物生长的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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