本试验于2013年在四川农业大学草业工程试验室进行。以广泛种植的拉丁诺(Ladino)白三叶为供试材料, 采用沙培法进行培育。具体方法为:将白三叶种子用0.1%的高锰酸钾溶液消毒后, 播种在装有石英砂的白色育苗盘(长35 cm, 宽25 cm, 高10 cm)中, 24℃光照培养箱中进行发芽, 待发芽7 d后用Hoagland全营养液继续培养, 温度为白天23℃, 夜晚19℃, 时长各为12 h, 相对湿度为70%, 当幼苗长至30 d(2片成熟叶片)时选取长势一致的材料用20%(W/V)聚乙二醇6000(PEG-6000)进行水分胁迫处理。

本试验共设对照(CK)和外源亚精胺(CK+Spd)2个处理(每处理设4个重复)和3个水分胁迫强度, 分别为:1)正常水分:CK(Hoagland全营养液正常培养)和CK+Spd(Hoagland全营养液加入0.05 mmol/L外源亚精胺正常培养); 2)轻度水分胁迫:CK(加20% PEG-6000的Hoagland全营养液胁迫3 d)和CK+Spd(在加20% PEG-6000的Hoagland全营养液中加入0.05 mmol/L的亚精胺胁迫3 d); 3)重度水分胁迫:CK(加20% PEG-6000的Hoagland全营养液胁迫9 d)和CK+Spd(在加20% PEG-6000的Hoagland全营养液中加入0.05 mmol/L的亚精胺胁迫9 d)。为了保持各个处理溶液中药品浓度一致, 从进行处理开始, 每3 d更换1次处理液。

1.3.1 相对含水量(relative water content) 叶片相对含水量采用烘干法测定^[14], 剪取叶片0.3 g, 用普通吸水纸将其包裹好, 放入装满水的50 mL离心管中, 盖好盖子, 放置于避光处静置24 h叶片吸水饱和后, 取出叶片, 擦干表面水分, 称量饱和鲜重, 然后置于鼓风烘箱中在105℃下杀青45 min, 然后75℃下烘至恒重, 称其干重, 重复4次, 取平均值。计算公式:相对含水量(%)=(鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)× 100。

1.3.2 超氧阴离子产生速率(the generation of superoxide anion)和过氧化氢含量(H₂O₂ content) 超氧阴离子递减速率参照Elstner和Heupel^[15]的方法稍加改进测定, 剪取叶片0.3 g, 用3 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)研磨, 5000 r/min, 离心10 min。取上清液1 mL, 加入pH 7.8磷酸缓冲液0.9 mL和10 mmol/L盐酸羟胺0.1 mL, 混合并25℃保温20 min。加入1 mL 17 mmol/L对氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L α -萘胺, 25℃保温20 min, 反应后的显色液加入3 mL乙醚, 充分摇匀, 静置分层, 吸取试管下层水相。530 nm下测定吸光值, 从标准曲线查得NO₂^-浓度, 计算O₂^-产生速率。H₂O₂含量参照Uchida等^[16]的方法稍加改动进行测定, 称取新鲜植物组织0.2 g, 按材料与提取剂1∶ 1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后, 转入离心管3000 r/min下离心10 min, 分层弃去残渣, 上清液即为样品提取液。用移液枪吸取样品提取液1 mL, 加入5%硫酸钛和浓氨水, 待沉淀形成后3000 r/min离心10 min, 弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次, 直到去除植物色素。向洗涤后的沉淀中加入2 mol/L硫酸5 mL, 待完全溶解后, 415 nm比色。

1.3.3 抗氧化酶活性(antioxidant enzyme activity)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量 粗酶液的提取, 称取植物鲜重0.4 g放入研钵中, 放入液氮(能够完全覆盖组织)研磨组织破碎后, 待液氮完全挥发后加入2 mL预冷的磷酸缓冲液和0.1 g PVP在冰上充分研磨, 然后转入离心管中, 再用2 mL缓冲液充分清洗研钵, 一并转入离心管中。4℃下15000 r/min离心20 min, 上清液即为粗酶提取液。将粗酶液分装入各管中进行MDA和抗氧化酶的活性测定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定^[17]; 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用核黄素-NBT法测定^[18]; 过氧化氢酶(catalase, CAT)活性采用紫外吸收法测定^[19]; 过氧化物酶活性(peroxidase, POD)采用愈创木酚显色法^[19]; 抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)采用紫外吸收法测定^[20]。

1.3.4 游离脯氨酸(free proline)含量及其代谢酶活性 采用茚三酮比色法测定^[21], 取不同处理的剪碎混匀叶片0.2 g, 分别置于大试管中, 加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液, 管口加盖玻璃球, 置于水浴中浸提10 min。取出试管待冷却至室温后, 吸取上清液2 mL, 加2 mL冰乙酸和3 mL显色液, 于沸水浴中加热40 min, 取出冷却后加入5 mL甲苯充分振荡, 以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层在波长为520 nm下比色, 从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度。鸟氨酸转氨酶(ornithine aminotransferase, OAT)活性采用茚三酮法测定^[22]; Δ ’ -吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)活性参照Garcia-Rios等^[23]的方法; 脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase, ProDH)活性参照Sanchez等^[24]的方法。

1.3.5 基因表达分析 白三叶叶片总RNA提取参照捷倍斯公司试剂盒(Plant RNA Kit)说明书, 提取的总RNA参照美国Bio-Rad Laboratories公司反转录试剂盒(iScriptTM cDNA Synthesis Kit)说明书进行反转录获得cDNA第一链。以白三叶肌动蛋白基因(β -Actin)为内参, 根据白三叶POD基因设计半定量引物。根据GenBank中的已知的红三叶(Trifolium pratense)SOD基因、蚕豆(Vicia faba)CAT基因和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)APX基因序列, GenBank编号分别为:AY434497.1、JQ043348.1、XM_003601995.1, 使用近源物种基因序列相似性的TBLASTX分析, 在白三叶已有的表达序列标签(EST)中鉴定出了白三叶SOD、CAT、APX基因序列片段, GenBank编号分别为:FY461274.1、FY464988.1和FY460674.1, 他们与前面已知相应基因序列的相似性分别达到94%, 93%和95%, 因而可用于设计引物(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验中所用到的引物 Table 1 All primers used in this experiment 基因 Gene 引物序列(5'-3')Primer sequence Cu/Zn SOD TCACCTTCCACTTTCAAACCTCTC TGTTGGACCTTCGTCTTCTTGAGT CAT GTCTTCTTTGTTCACGATGGGATG GAAAGTGGGAGAAGAAGTCAAGGAT POD TCTAGGGCAACGGTTAATTCATTC GGTACGGATTTTCCCATTTCTTG APX GCAGCATCAGTTGGCAAGACC GGCAAACCTGAGACTAAATACACGA β -Actin TTACAATGAATTGCGTGTTG AGAGGACAGCCTGAATGG

表1 试验中所用到的引物 Table 1 All primers used in this experiment

以获得的cDNA第一链为模板进行PCR扩增。β -Actin、SOD、CAT和POD基因反应程序为:94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃ 5 min。APX基因反应程序为:94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 62.5℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃ 5 min。

采用Excel 2003进行绘图; SAS 9.1软件进行方差分析和显著性分析(P< 0.05); Quantity one进行半定量分析。

植物叶片的相对含水量(RWC)可以直接反应植物体在干旱环境下水分的亏缺程度。随着水分胁迫强度的加大, 白三叶叶片RWC呈明显的下降趋势。正常水分和轻度胁迫下, 外源亚精胺对白三叶叶片相对含水量没有显著影响。重度胁迫下CK处理和CK+Spd处理的RWC分别下降了57%和46%, 此时CK+Spd处理维持了显著较高的RWC(图1)。

图1

Fig.1

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	图1 亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片相对含水量的影响. 不同字母表示在0.05水平上差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.1 Effects of spermidine on relative water content under water stress. Different letters indicate significant differences at P< 0.05 level. The same below.

水分胁迫过程中, 不同处理超氧阴离子产生速率、H₂O₂和MDA含量反应一致, 都随着水分胁迫强度的加大不断增大, 说明水分胁迫过程中活性氧和膜脂过氧化产物不断积累, 细胞氧化性损伤不断增大(图2)。与正常水分相比较, 轻度水分胁迫使CK处理的超氧阴离子产生速率和MDA含量显著上升, 但并未对CK+Spd处理造成显著影响, 而CK+Spd处理分别在轻度水分胁迫和重度水分胁迫下维持了显著低的超氧阴离子产生速率和MDA含量, 说明外源亚精胺有效缓解了水分胁迫下白三叶叶片膜脂过氧化程度(图2A, C)。如图2B所示, 轻度水分胁迫和重度水分胁迫都使CK和CK+Spd处理的H₂O₂含量显著增高, 但添加外源亚精胺处理显著降低了白三叶在轻度和重度胁迫强度下的H₂O₂水平, 一定程度上缓解了水分胁迫带来的氧化伤害。

图2

Fig.2

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	图2 亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片活性氧成分和MDA的影响Fig.2 Effects of spermidine on the generation rate of superoxide anion, H2O2 and MDA content under water stress

轻度水分胁迫下CK+Spd处理的叶片SOD活性比正常水分条件下高出了2.7个百分点达到显著水平, 而CK处理几乎处于同一水平, 且CK+Spd处理的SOD活性在轻度和重度胁迫下显著高于CK处理(图3A)。轻度水分胁迫使CK和CK+Spd处理的CAT活性分别上升了65%和84%, 二者之间存在显著差异, 重度胁迫下两处理的CAT活性又急剧下降, 但CK+Spd处理下降幅度小于CK处理, 维持了显著较高的CAT活性(图3B)。外源亚精胺显著提高了正常水分和轻度胁迫条件下白三叶叶片POD活性, 但此种效益在重度胁迫下并未表现出来(图3C)。APX活性随着胁迫程度的增大而升高, 重度胁迫下, CK和CK+Spd处理的APX活性分别是正常水分条件下的1.6和1.8倍, 此时CK+Spd处理的APX活性显著高于CK处理(图3D)。

图3

Fig.3

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	图3 亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片抗氧化保护酶活性的影响Fig.3 Effects of spermidine on the activities of anti-oxidative enzyme under water stress

半定量RT-PCR结果显示, SOD基因的相对表达量随着胁迫强度的加大逐渐增强, 与SOD活性变化相一致, 水分胁迫诱导了SOD基因的表达, 而添加外源亚精胺能进一步提高SOD的表达量, 在重度胁迫下, CK+Spd处理维持了显著较高的SOD表达量(图4A)。正常水分和轻度水分胁迫下CK和CK+Spd处理的CAT基因稳定表达无显著差异, 但重度胁迫下CK处理的叶片CAT基因表达量显著降低, 而CK+Spd处理的叶片CAT基因仍具有显著较高的表达量(图4B)。

图4

Fig.4

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	图4 亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片抗氧化酶基因表达的影响. W:正常水分Well watered; M:轻度水分胁迫Mild water stress; H:重度水分胁迫Heavy water stress.Fig.4 Effects of spermidine on the gene expression of anti-oxidative enzyme under water stress

水分胁迫同时也诱导了POD基因的相对表达量, 但添加外源亚精胺处理使正常水分和胁迫下白三叶叶片POD表达量进一步提升(图4C)。轻度水分胁迫下, CK和CK+Spd处理的POD表达量显著增加, 分别比正常水分下上升了121%和135%, 二者差异显著(图4C)。外源亚精胺对正常水分下白三叶APX基因的表达量影响显著, 大大激活了APX基因的表达, 但轻度水分胁迫下有所下降。CK处理的APX基因表达在轻度胁迫下有所上升, 但未达到显著水平, 重度胁迫下CK+Spd处理的APX基因表达是CK处理的2.4倍, 达到显著水平(图4D)。

游离氨基酸含量在响应水分胁迫的过程中急剧升高, 重度胁迫下CK和CK+Spd处理的白三叶叶片游离脯氨酸含量分别是胁迫前的29和34倍, 此时两处理的游离氨基酸含量没有表现出显著差异, 但CK+Spd处理在轻度胁迫下积累了显著较高的游离脯氨酸(图5A)。

图5

Fig.5

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	图5 亚精胺对水分胁迫下白三叶叶片脯氨酸含量及代谢酶活性的影响Fig.5 Effects of spermidine on free proline content and activities of its metabolic enzyme under water stress

鸟氨酸转氨酶(OAT)和Δ ’ -吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成代谢两个不同途径的关键酶, OAT活性随着水分胁迫强度的增加逐步升高, 特定水分胁迫强度下CK和CK+Spd处理间均未表现出显著差异(图5B)。而P5CS活性在CK处理中呈先下降后上升的趋势, CK+Spd处理的P5CS活性在正常水分和轻度胁迫下变化不大, 重度胁迫下快速上升, 且活性在3种胁迫强度下均显著高于CK处理组(图5C)。这说明外源亚精胺主要通过诱导P5CS活性从而促进脯氨酸在白三叶叶片内的积累。ProDH是脯氨酸分解代谢途径的关键酶, 在响应水分胁迫的过程中, 两个处理的ProDH活性先升高后下降, 轻度胁迫下有较大幅度的上升。轻度和重度水分胁迫下, CK+Spd处理的ProDH活性均显著高于CK处理, 说明外源亚精胺处理促进了白三叶叶片脯氨酸在水分胁迫下的分解代谢(图5D)。