引用本文
张胤冰, 孙鑫博, 樊波, 韩烈保, 张雪, 袁建波, 许立新. 结缕草 ZjNAC基因的克隆与表达分析 .草业学报, 2015,25(4): 239-245
ZHANG Yin-Bing, SUN Xin-Bo, FAN Bo, HAN Lie-Bao, ZHANG Xue, YUAN Jian-Bo, XU Li-Xin. Cloning and expression of ZjNAC from Zoysia japonica .ACTA PRATACULTUAE SINICA, 2015,25(4): 239-245  
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结缕草 ZjNAC基因的克隆与表达分析
张胤冰1, 孙鑫博2, 樊波1, 韩烈保1, 张雪1, 袁建波1, 许立新1*,*
1.北京林业大学草坪研究所,北京 100083
2.河北省作物生长调控重点实验室,河北农业大学,河北 保定 071001
*通信作者Corresponding author. E-mail:lixinxu@bjfu.edu.cn

作者简介:张胤冰(1990-),女,黑龙江哈尔滨人,在读硕士。E-mail:13020019042@163.com

收稿日期: 2015-09-23
基金: 中央高校基本科研业务费专项资金(BLX2012034)和国家高新技术研究发展计划项目(2013AA102607)资助
摘要

NAC类家族的基因是植物特有的转录因子,并且它在植物的生长发育中发挥着重要的作用。本研究以结缕草为研究材料,对结缕草转录组数据库利用local blast的办法克隆出1个NAC类转录因子。为深入探讨和研究NAC类转录因子在植物逆境生理上的作用奠定基础。通过与水稻的 OsNACs家族成员进行进化树分析,结合蛋白分析,QRT-PCR等的方式探索其生物学功能。实验结果表明,该基因长度为1496 bp,包含1个完整开放阅读框(ORF),长度为1332 bp,编码449个氨基酸,该蛋白含有1个NAM结构域。与水稻的NAC类转录因子家族的系统进化树对比发现,它与OsNAC036近缘性最高,因此将该基因命名为 ZjNAC036。QRT-PCR结果显示,该基因在干旱情况下表达量呈上升趋势,并且干旱处理8 h的时候,差异倍数最大,达到了50倍左右,而在盐胁迫、低温胁迫下没有规律性变化。这表明 ZjNAC036在干旱逆境生理上可能有重要的作用,而在高盐及寒冷的逆境生理方面可能作用不大。

关键词: 结缕草; NAC转录因子; 进化树; 表达分析
doi: 10.11686/cyxb2015453
Cloning and expression of ZjNAC from Zoysia japonica
ZHANG Yin-Bing1, SUN Xin-Bo2, FAN Bo1, HAN Lie-Bao1, ZHANG Xue1, YUAN Jian-Bo1, XU Li-Xin1,*
1.Institute of Turfgrass Science, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China
2.Key laboratory of crop growth regulation of Hebei Province, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China
Abstract

Proteins in the NAC family (including NAM, ATAF1/2, and CUC2 proteins) are plant-specific transcription factors that play critical roles in plant development. To explore and exploit the excellent resistance-gene resources of zoysia ( Zoysia japonica), a gene encoding a NAC transcription factor ( ZjNAC) was cloned by blasting the Zoysia transcriptome database. The biological function of the cloned ZjNAC gene was explored by a phylogenetic analysis with OsNACs of rice ( Oryza sativa) combined with protein and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses. The bioinformatics analysis showed the cloned ZjNAC gene was 1496 bp long, and contained a 1332 bp open reading frame (ORF) encoding 449 amino acids with a NAM domain. In a phylogenetic analysis, the cloned ZjNAC gene showed the highest homology to OsNAC036 from rice, and so the cloned gene was designated as ZjNAC036. The qRT-PCR analysis showed that ZjNAC transcript levels increased under drought stress, reaching peak levels (approximately 50-fold that in the control) after 8 h of drought stress. The transcript levels of ZjNAC did not show obvious variations under salt stress or cold stress. Together, these results show that the protein encoded by ZjNAC036 may play an important role in the drought stress response, rather than the salt or cold stress responses.

Keyword: Zoysia japonica; NAC transcription factor; phylogenetic tree; expression analysis

日本结缕草(Zoysia japonica), 禾本科结缕草属, 原产于亚洲东南部, 是一种耐高温, 耐干旱的C4类暖季型草坪草, 由于其抗逆性强, 耐践踏, 再生性强等优良特性而成为了我国重要的草坪草种质资源[1, 2, 3]。结缕草是异源四倍体植株, 具有相当小的基因组尺寸[4], 这些使得结缕草成为了重要的草坪模式植物。而干旱目前成为了全球共同关注的难题, 我国也是如此, 水资源短缺成为了限制植物生长发育, 尤其是限制草坪草正常生长的重要因素[5, 6]。因此, 在园林绿化及运动球场绿地的节水灌溉成为当前研究草坪草的焦点, 通过生物技术方法培育耐旱耐盐新品种也成为一项重要的手段。

近年来, 如TCP, MYB类的植物转录因子被广泛研究, 其中, NAC作为植物特异性转录因子, 是目前发现的数量最大的转录因子家族之一。研究表明, NAC家族基因参与多种植物的发育及形态建成, 并且在植物的生长发育, 器官发育以及各种生物, 非生物胁迫等方面发挥着重要的作用。NAC转录因子家族的蛋白都含有1个靠近N端的, 高度保守的NAC结构域, 可以联结DNA以及其他蛋白[7]。其命名来自于矮牵牛(Petunia hybrida)的NAM基因以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的ATAF1, ATAF2, CUC2基因。最早发现是在矮牵牛的突变体中, 这个突变体的胚胎不含有顶端分生组织, 无法形成茎顶端分生组织, 经鉴定是一个NAM基因, 与其他几个未知基因共有1段保守的N端区域[8]。而后Aida等[9]在拟南芥的杯状子叶突变体中克隆了CUC2基因, 该基因编码的蛋白N末端与矮牵牛NAM蛋白具有较高的同源性。这一基因在植物胚胎及花器官的发育中扮演了重要的角色。随后在水稻(Oryza sativa), 小麦(Triticum aestivum)等物种中相继发现, 目前研究显示, 在拟南芥中共发现了105个NAC成员, 水稻中发现了75个NAC成员[10], 研究表明, NAC类转录因子在植物的生长发育, 器官建成方面发挥着十分重要的作用[11]。Yamaguchi等[12]发现拟南芥中的一个NAC domain的转录因子VND-INTERACTING2对拟南芥的木质部导管分化起到负调控作用。同时也发现胁迫诱导的NAC转录因子基因在干旱、高盐等非生物胁迫中直接或间接地参与调控作用[13]。Hu等[14]发现, 过量表达SNAC1基因可以增强水稻的耐胁迫能力。同时还发现过量表达SNAC2, ONAC045等可以增强水稻的耐低温、干旱以及高盐的能力[15, 16]。拟南芥ATAF1基因受干旱、高盐、ABA、病原菌等诱导表达, 过量表达该基因能明显提高植株耐旱性[17]。并且研究显示ATAF2对某些拟南芥病程相关蛋白起抑制作用[18]。Zheng等[16]发现过量表达ONAC045基因提高了水稻的耐干旱能力。过量表达ABA响应基因OsNAC52, 可以激活转基因拟南芥下游基因的表达, 从而提高了植物的耐旱性[19]。一个胁迫诱导基因ZmSNAC1在拟南芥中过量表达后, 可以提高幼苗对脱水胁迫的耐受力[20]。在拟南芥中, 过量表达高粱(Sorghum vulgare)的NAC基因SbSNAC1后, 与野生型相比明显提高了抗旱能力[21]。目前, 从各种植物中克隆到了许多的NAC转录因子基因, 并发现其参与并调控了许多植物非生物胁迫响应机制, 尤其是干旱脱水胁迫, 如拟南芥ATAF1, 水稻SNAC1, 烟草(Nicotiana tabacum)NtNAC-R1[22]等, 但是在草坪草日本结缕草中却鲜有报道。

本研究利用local blast的办法, 从结缕草转录组比对得到了ZjNAC036基因序列, 并通过RT-PCR等方法从日本结缕草中分离出了该基因。生物信息学预测了该基因的功能, 并对该基因在胁迫处理下的时间及空间表达模式进行了分析, 研究其与抗旱的相关性, 为结缕草抗旱性分子育种奠定技术基础, 同时为该基因的进一步研究与利用提供有效的参考依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

选用的日本结缕草品种compadre, 采自于北京林业大学草坪研究所。2014年6月种植于北京林业大学草坪研究所智能温室[(25± 1)℃, 16 h光照, 12000 lx, 8 h黑暗, 相对湿度75%]中。先将种子播种于穴盘中, 发芽3周后, 将幼苗转移至直径15 cm, 深14.5 cm的花盆中, 土壤成分为沙土和蛭石(1∶ 1)。出苗8周后用150 mmol/L NaCl, 4℃低温及20% PEG6000分别处理材料。每个处理进行3次生物学重复, 设置了8个取样点, 分别为0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 h, 取不同处理时间的叶片, 液氮速冻, 置于-80℃超低温冰箱储存备用。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

采用Trizol 总RNA提取试剂盒(Invitrogen, 美国)分别提取日本结缕草叶片的总RNA。用DNaseⅠ (Promega, 美国)去除剩余的基因组DNA, 使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性, 并用Nanodrop 2000 检测其浓度及纯度。以总RNA为模板, 合成cDNA(全式金, AE301), 储存于-20℃冰箱备后续实验使用。

1.3 ZjNAC基因的克隆

通过结缕草根部的转录组数据初步分析, 得到了一段含有NAC转录因子家族NAM 结构域的序列, 比对分析其包含有完整的ORF区。根据序列片段设计1对基因特异性引物, QS: 5'ATGGCGCAAACTAGCCTGCCTCC3'; QA:5'TTCCAGGTCAATCAGGGGAATGGG3', 以日本结缕草总RNA反转录的cDNA为模板, 扩增目的基因, 获得包含有完整ORF的ZjNAC基因。反应程序为:95℃预变性5 min; 95℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸110 s, 30个循环; 72℃再延伸10 min; 4℃保存。将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分离, 利用DNA回收试剂盒回收, 纯化目的片段, 与pMD®18-T载体(TaKaRa)连接, 转化大肠杆菌感受态细胞, 经蓝白斑筛选, 菌液PCR鉴定。

1.4 测序与分析

经鉴定的阳性克隆菌液送Invitrogen生命技术公司进行测序。序列分析及同源性分析采用NCBI的blast在线分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)及DNAMAN等软件分析。利用NCBI比对序列查找完整的ORF框。利用PBIL-IBCP在线预测ZjNAC036蛋白的二级结构。Blastx搜索其他物种的相似蛋白, 用DNAMAN进行序列的多重比对, MEGA6软件进行进化树分析。

1.5 ZjNAC的表达分析

利用BIO-RAD CFX96实时荧光定量PCR仪对日本结缕草compadre的各种胁迫取样点的cDNA模板进行荧光相对定量分析。目的基因的扩增引物为:Actin的扩增引物为Actin-F: 5'GCTCAGTCCAAGAGAGGTATTCA3', Actin-R: 5'TGATGCCAGATCTTCTCCATATC3'。qRT-PCR反应采用20 μ L反应体系。qRT-PCR 的反应程序采用三步法, 程序如下:50℃ 2 min; 94℃预变性10 min; 95℃变性20 s; 58℃退火20 s; 72℃延伸15 s; 65℃ 5 s; 95℃ 5 s; 39个循环。每个处理样品设两个生物学重复。利用2-Δ Δ CT方法进行数据分析。

2 结果与分析
2.1 结缕草ZjNAC036基因克隆与序列分析

通过克隆和RT-PCR方法, 从结缕草中克隆到ZjNAC036新基因。以结缕草的cDNA为模板, 以ZjNAC-F, ZjNAC-R为引物扩增目的基因, 均获得大小约为1000 bp的片段(图1)。PCR产物回收纯化后连接T1中间载体, 经测序分析结果显示, 该基因的全长为1496 bp, 含有1332 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF), 共编码449个氨基酸, 相对分子量为50.13 kDa, 理论等电点为4.15(图2)。含有碱性氨基酸(H, K, R)42个; 酸性氨基酸(D, E)72个。该蛋白中相对含量比较多的氨基酸为丝氨酸(Ser)39个; 谷氨酸(Glu)37个, 含量比较少的氨基酸为色氨酸(Trp)5个; 半胱氨酸(Cys)9个。根据NCBI数据库分析该蛋白的保守结构域发现, 在N端包含有一个典型的NAM保守结构域(图3)。经NCBI/BLASTx分析表明该序列与玉米NAC类的基因相似度最高, 达到79%, 由此推测克隆得到的基因为NAC类转录因子基因, 后经过与水稻的NAC类转录因子家族成员的比对发现, 该基因与水稻OsNAC036的亲缘关系最近, 故将结缕草的NAC家族基因命名为ZjNAC036。

图1 ZjNAC036基因的PCR结果Fig.1 PCR product of ZjNAC036 gene

图2 ZjNAC036核苷酸及编码的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence of ZjNAC036 gene

利用PBIL-IBCP在线预测ZjNAC036蛋白的二级结构(图4), 结果表明, ZjNAC036蛋白含有α 螺旋28.51%, β 转角7.35%, 无规则卷曲49.67%, 延伸链14.48%。其中, 无规则卷曲所占的比例最高, 连接着其他二级结构原件, 如α -螺旋, β -转角和延伸链。利用HMMTOP在线软件预测表明该蛋白没有跨膜区域。

2.2 ZjNAC036基因序列的系统进化树分析

根据Ooka等[10]发表的文章, 获得水稻中NAC转录因子家族所有成员基因的序列号, 然后从NCBI网站上检索并获得这些NAC家族基因序列, 进而构建ZjNAC与水稻所有NAC转录因子基因家族成员的系统进化树。系统的进化关系表明, 日本结缕草ZjNAC036与水稻的OsNAC036的同源性最高。

2.3 ZjNAC036基因表达分析

实时荧光定量RT-PCR结果显示(图5), 以水处理的日本结缕草为对照, 通过实时荧光定量RT-PCR分析了干旱胁迫、盐胁迫、低温胁迫下的结缕草叶片中ZjNAC036基因的时空表达。发现该基因在干旱胁迫处理的2~48 h间的表达量均高于对照水平, 在处理4 h时基因的表达量显著提高, 8 h时达最大表达量。随着处理时间的延长, 12 h后, 表达量下降; 在盐胁迫处理后的2 和24 h, 表达量下调, 其余时间段呈上升趋势; 在低温胁迫下, 该基因在1 和2 h时, 表达量下调, 而从3 到48 h, 该基因表达量都高于对照。结果表明, ZjNAC036基因受干旱诱导调控表达, 干旱条件下, 表达量上调; 而高盐和低温胁迫下, 该基因并无明显规律变化。

3 讨论

NAC类转录因子是植物中特有的一类调控因子, 一般通过与目标基因的启动子中特定的DNA序列相结合从而达到激活或抑制其靶基因的表达[23, 24]。本研究通过电子克隆及RT-PCR的方法, 获得了日本结缕草的一个NAC转录因子家族基因:ZjNAC036, 利用相关的生物信息学软件对该基因的碱基序列及氨基酸序列进行比对分析后, 发现该基因上具有植物特异性的NAC转录因子特征, 如蛋白的N端具有相对保守的NAC功能结构域, 因此推测该基因属于NAC转录因子家族成员。已有研究表明, NAC转录因子的N端存在一个高度保守的NAC结构域, 该结构域一般由约150个氨基酸组成。而其C端是变化多样的转录调控域[7]。本研究中得到的ZjNAC036基因的蛋白序列, 经与其他物种比对分析后发现, 这些转录因子在NAC结构域处序列高度保守, 尤其是与谷子(Setaria italica)和玉米(Zea mays)的NAC转录因子基因的蛋白同源性最高, 该结果表明日本结缕草在进化上与谷子和玉米的亲缘关系最近。而在C端的序列差异较大, 这种结构说明了ZjNAC036蛋白具有NAC家族的高度保守性, 并且具有激活功能的多样性, 也表明该蛋白在结缕草中可能发挥着十分重要的作用。

目前研究表明, NAC类转录因子不仅参与植物的生长发育过程, 还直接或间接的在植物的生物及非生物胁迫的响应中起到十分重要的作用[23]。Hu等[15]研究显示, 水稻SNAC1基因受保卫细胞脱水诱导表达, 过表达的转基因水稻与野生型相比展现出更好的耐旱性和耐盐性。本课题组对日本结缕草NAC转录因子ZjNAC036基因的非生物胁迫进行了时空表达模式分析, 发现在高盐, 低温环境的胁迫下, 该基因表达量总体呈上升趋势, 但并未有明显的相关性, 而在干旱胁迫下表达量呈先上升后下降的趋势, 不同处理间的差异达到极显著水平, 说明ZjNAC036基因可能参与调控植物的干旱相关的响应机制, 并且很有可能是特异响应干旱胁迫的基因。

图3 ZjNAC036蛋白的保守结构域Fig.3 Conserved domain of ZjNAC036 protein

图4 ZjNAC036蛋白的二级结构预测
蓝色:α -螺旋; 红色:延伸链; 绿色:β -转角; 浅紫色:无规则卷曲。Fig.4 Predicted secondary structure of ZjNAC036 protein
Blue: Alpha helix; Red: Extended strand; Green: Beta turn; Purple: Random coil.

图5 ZjNAC036基因在胁迫诱导后的相对表达量Fig.5 The relative expression of ZjNAC036 gene induced by stress

NAC转录因子家族在参与植物生长发育及生物、非生物胁迫中发挥重要作用, 具有普遍的生物学功能多效性, 使其在植物的生物育种实践中具有较大的应用潜力。如拟南芥(ATAF1, ATAF2, DR26), 水稻(SNAC1, ONAC045)等, 而结缕草中NAC转录因子家族成员研究甚少, 大部分的成员功能尚未确定。本实验克隆到的ZjNAC036基因受非生物胁迫的诱导表达, 可能在结缕草抗逆遗传改良中具有一定的利用价值, 为今后的深入研究提供有效的证据。

4 结论

本研究从日本结缕草中克隆得到了1个NAC类转录因子, 命名为ZjNAC036。该基因包含一个完整的开放阅读框(ORF), 推测编码449个氨基酸。ZjNAC036蛋白N端中含有一个NAM保守结构域。ZjNAC036基因受干旱诱导, 在该条件下, 表达量出现了上调, 且在处理8 h, 表达量差异最大。

The authors have declared that no competing interests exist.

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