作者简介:山宝琴(1970-),女,新疆乌鲁木齐人,副教授,博士。E-mail:xiaoshanbao@163.com
研究先期筛选了4种陕北乡土植物黄花蒿、艾蒿、柠条和沙打旺,及植物根围匹配的丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)真菌菌种,通过盆栽试验测定AM真菌孢子密度、宿主植物根系菌丝侵染率、植物株高、干重和土壤总石油烃的降解率。旨在研究接种AM真菌对污染土壤中总石油烃的降解率以及对宿主植物生长的影响, 验证菌根修复效果并筛选最佳宿主植物和菌种组合。结果表明,1) AM真菌孢子密度最大值出现在石油浓度0~5000 mg/kg土壤,并随污染浓度加大而显著减少,40000 mg/kg 时达最小值。植物菌根侵染率在土壤被污染的情况下显著高于无污染对照,同时接种AM后孢子密度及菌根侵染率均显著高于未接种;2) 植物株高和干重都随石油污染浓度加大而显著降低,接种处理后植物株高平均增加16.77%,植物鲜重平均增加了22.56%; 3) 植物接种AM真菌后对石油烃降解率明显提高,比不接种平均增加15.35%。其中,柠条-地球囊霉组合的石油烃降解率最高(平均为73.81%);4) 相关分析表明,接种AM真菌后石油烃降解率与石油烃浓度呈极显著负相关,与植物株高、干重和真菌孢子密度呈显著正相关。
A new bioremediation technique utilizing the symbiotic function between host plant and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) for petroleum contaminated soil was investigated in Northern Shaanxi in 2015. Four species of native plants in Northern Shaanxi studied were Artemisia annu, Artemisia argyi, Caragana korshinskii and Astragalus adsurgens, and AMF species were isolated from the rhizosphere of each species and used to inoculate field grown plants in contaminated soil to test effects of AMF on the degradation of petroleum hydrocarbon in soil and to select the best plant-AMF match. It was found that AMF spore densities were highest in soil with 0-5000 mg petroleum/kg soil, and significantly decreased with increasing petroleum concentration. AMF hyphal densities were higher in petroleum contaminated soil than in uncontaminated soil. The inoculation with AMF increased spore density and the percentage of AM colonization. Plant height and dry weight were decreased with increasing petroleum concentration, but both were significantly promoted by AMF inoculation AMF, with plant height increased by 16.77% and dry weight by 22.56%. Degradation efficiency of petroleum hydrocarbon in soil was enhanced by AMF inoculation, and was 15.35% higher than that of uninoculated soil. Among the plant-AMF combinations, Caragana korshinskii and Glomus geosporum was the best for petroleum degradation, and the degradation rate was 73.81% after 2 months. After inoculation with the selected AMF species, degradation rates of petroleum hydrocarbon and petroleum concentration in soil showed an obvious negative correlation, but degradation rates were significantly positively correlated with spore density, plant height and plant dry weight.
陕北地区石油资源丰富, 但在开采运输、贮存及炼化过程均会带来石油污染, 尤其是石油泄漏事故频发, 造成周边荒坡林地等土壤污染严重, 甚至随雨水淋流造成延河水体污染。陕北属典型的黄土高原沟壑地貌, 水源匮乏, 生态脆弱, 石油污染显著改变原有土壤理化性质[1], 对当地生态环境和生物多样性的危害难以评估。
诸多石油污染土壤修复方法中, 微生物-植物联合修复技术始终是研究热点[2, 3]。丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM) 是由真菌与植物根系所建立的一种互惠共生体, 植物通过与AM真菌共生提高对矿质营养和水分的吸收而增强对逆境的耐受力[4, 5]。研究证实AM真菌具有降解复杂有机污染物的能力, 丛枝菌根的形成可明显提高植物对石油污染土壤的修复效率[6]。
相比菌根生物技术在矿山复垦、退化生态环境修复等领域的运用[7, 8, 9], 丛枝菌根对石油污染物的降解研究尚在起步阶段, 学者们从丛枝菌根的降解效果[10, 11], 单接种和复合菌种效果对比[12], 接种AM真菌对农作物中石油污染物含量影响[13]等方面进行了积极的探索, 但菌种的选取往往缺乏宿主植物的针对性, 尤其未见针对陕北土壤及乡土植物的相关研究。丛枝菌根的功能强弱首先取决于共生体系对土壤环境的适应性, 而且外来菌种的野外施用存在生态安全隐患, 因此先期筛选特定生态系统中宿主植物-AM真菌-土壤适宜组合, 有利提高污染土壤修复效果。AM真菌在陕北黄土高原分布具有丰富的多样性[14], 因此AM真菌-植物联合修复石油污染土壤兼具普适性和实用性。本研究选取了4种陕北油井旁常见乡土植物, 黄花蒿(Artemisia annua)、艾蒿(Artemisia argyi)、柠条(Caragana korshinskii)和沙打旺(Astragalus adsurgens), 并据植物根围AM真菌群落丰度和优势度选取了3种AM真菌菌种, 通过盆栽试验测定不同石油烃污染浓度土壤中AM真菌孢子密度和宿主植物根系菌丝侵染率, 对比植物接种AM真菌后土壤中石油烃污染的降解率, 分析石油污染条件下接种AM真菌对植物生长的作用, 旨在选取最佳植物-AM真菌组合, 为促进菌根生物技术在陕北石油污染土壤修复中的应用与发展提供科学依据。
1.1.1 AM真菌菌种的确定
为确保AM真菌应用效果, 通过查阅文献[5]并系统调查了野外目标植物根围AM真菌物种多样性, 从延长油田股份有限公司川口采油厂周边油污土壤中筛选了球囊霉属(Glomus) 的地球囊霉(G. geosporum)、缩球囊霉(G. constrictum), 以及无梗囊霉属(Acaulospora)的詹氏无梗囊霉(A. gerdemannii)。按照柠条-地球囊霉、艾蒿-地球囊霉、沙打旺-缩球囊霉和黄花蒿-詹氏无梗囊霉4种组合进行试验研究。
菌剂扩繁方法:土样与干净的河沙混匀, 121 ℃高温灭菌后置于温室, 孢子筛选后将单孢接种于黑麦草根部, 对AM真菌进行加富诱集培养, 经2个月扩繁后获得含有AM真菌孢子、菌丝和侵染根段的根际土。接种方法:将菌剂(孢子密度约为21个/10 g风干土)施用到长势良好的植物幼苗根围土壤中, 接种量为每盆150 g菌剂。
1.1.2 石油污染浓度的确定
本研究前期调查表明, 陕北油区污染土壤中总石油烃含量为168~22920 mg/kg, 因此设定原油添加浓度为0, 5000, 10000, 20000, 40000 mg/kg, 实测土壤中总石油烃类含量为0, 3296, 8736, 18264, 35200 mg/kg, 本文总石油烃降解率的计算均以实测值为基准。
原油取自延长石油集团川口采油厂, 供试土壤取自采油厂周围山野黄绵土(N 36° 29'51″, E 109° 39'34″, 海拔1310 m), 供试4种植物黄花蒿、艾蒿、柠条和沙打旺的种子, 于2014年秋季在延安大学植物园采集并低温保存。
2015年4月盆栽试验, 4种陕北乡土植物均分设接种AM真菌(PAM)组和无接种AM真菌(PN)组, 每组设3次重复。将盆放置在温度光照基本一致的地方, 保持良好的光照和通风, 花盆随机分组排列, 并定期调换, 以达到局部控制的目的。供试花盆的规格为直径20 cm, 深20 cm, 花盆底部有孔口, 每盆装土壤约1 kg。种子先在恒温培养箱中催芽, 每盆播发芽种子30粒, 覆土1 cm左右。经间苗处理后保持每盆20株幼苗, 每天2次浇灌[15]。接入AM真菌时测定初始总石油烃含量, 培养2个月以后测定土壤中残余总石油烃含量和植物生物量。
1.3.1 AM真菌孢子密度
用湿筛倾注蔗糖离心法[16]对10 g风干土壤中的AM真菌孢子进行分离。在体视镜下挑取AM真菌孢子对孢子进行计数, 将每10 g风干土中的含孢量计为孢子密度。
1.3.2 菌根侵染率测定
将收集的根样切成1 cm的根段, 用KOH透明-乳酸甘油酸性品红染色法测定根组织内菌丝的侵染发育状况[17]。将25条约1.0 cm长的细根置于Olympus BXSO型显微镜下观测, 采用网格交叉法测定根系的菌根侵染率。
1.3.3 石油烃降解率
称取土壤经无水硫酸钠充分干燥后, 经S-316专用提取剂(六氯四氟丁烷)振荡萃取、硅胶过滤, 用非分散红外法(OCMA-305测定仪)测定[18]。计算公式如下:
油含量(mg/kg)={Invalid MML}
供试土壤质地为轻壤黄绵土, 土壤的主要理化性质见表1。
| 表1 不同石油污染浓度土壤的理化性质 Table 1 Soil physical property in different concentrations of petroleum hydrocarbon |
用Excel处理实验数据并绘图, 用SPSS 18.0生物统计软件进行单因素方差(One-way ANOVA)分析和Pearson双变量相关分析。
由表2分析可知, 无论有无接种菌剂, 4种植物的菌根侵染率在土壤被污染的情况下均显著高于无污染对照, 且最大值出现在40000 mg/kg石油浓度, 同时接种情况下菌根侵染率显著高于未接种。无论是否接种, 有3种植物的孢子密度最大值均出现在石油浓度为5000 mg/kg, 后随污染浓度加大而显著减少, 40000 mg/kg 时达最小值。只有沙打旺在5000~20000 mg/kg浓度范围都有较高的值, 40000 mg/kg 时显著减少。
| 表2 不同石油污染浓度土壤中AM真菌孢子密度及菌根侵染率 Table 2 Spore density and hyphal rate of arbuscular mycorrhizae fungi in different petroleum hydrocarbon concentration |
植物株高和生物量是修复石油污染度的指示指标, 4种植物无论接种与否, 株高最大值都出现在5000~10000 mg/kg浓度, 后随石油污染浓度加大而显著降低, 表明重度石油烃污染对植物株高有较强的抑制作用。比较接种与不接种两种情况的差异性, 接种菌剂后植物株高平均增加16.77%, 其中沙打旺接种后株高平均增加28.23%, 柠条接种后株高平均增加25.09%, 增加幅度随石油污染浓度和植物种类的不同而表现差异(图1)。
图2分析表明接种条件下, 黄花蒿、艾蒿和柠条的干重都是在5000 mg/kg浓度时最大, 后随污染浓度的增加而显著降低, 不同浓度间差异明显。只有沙打旺干重最大值出现在10000 mg/kg, 但和5000 mg/kg浓度相比未达显著差异。未接种条件下, 黄花蒿和艾蒿的干重是在5000 mg/kg最大, 柠条和沙打旺的干重最大值出现在10000 mg/kg, 后随污染浓度增加显著降低。分析接种菌剂后的效果, 植物干重比未接种时平均增加了22.56%, 其中艾蒿最显著, 增加了33.75%, 其次是柠条28.00%, 黄花蒿16.25%, 沙打旺12.25%。其中5000 mg/kg时效果最明显, 40000 mg/kg时4种植物干重平均只增加了9.25%。
植物根围接种AM真菌菌剂明显有助于提高土壤石油烃降解率, 试验表明接种AM菌群(PAM)比不接种(PN)平均高出15.35%, 其中石油烃浓度5000 mg/kg时最显著, 平均高出17.62%。浓度为40000 mg/kg时差异最小为10.52%。
由图3分析, 接种AM真菌后的降解率变化随物种本身和石油烃污染浓度不同而呈现差异。黄花蒿、艾蒿和柠条的最大石油烃降解率都出现在5000 mg/kg浓度, 而后降解率随污染浓度加大而显著降低。沙打旺最大石油烃降解率则出现在10000 mg/kg浓度, 显著高于5000 和20000 mg/kg, 40000 mg/kg时达最小值。4种植物与AM菌种组合中降解率从高到低依次为:柠条-地球囊霉组合平均为73.81%, 单值最高为83.69%; 艾蒿-地球囊霉组合平均为67.85%, 单值最高为81.63%; 沙打旺-缩球囊霉组合平均为67.82%, 单值最高为76.90%; 黄花蒿-詹氏无梗囊霉组合65.56%, 单值最高为73.90%。
相关分析表明, 接种AM真菌后石油烃降解率与土壤石油烃浓度呈极显著负相关, 与植物株高、干重和真菌孢子密度呈显著正相关; 未接种石油烃降解率与土壤石油烃浓度呈显著负相关, 与植物干重呈显著正相关。
| 表3 相关性分析 Table 3 Correlation analysis between plant growth and soil factors |
自然界AM真菌资源丰富[19], AM真菌是靠宿主植物的碳水化合物来完成生命周期的专性活体微生物。耿春女等[10]研究证明AM真菌可以存活在石油污染土壤中, 本研究表明石油污染土壤中AM真菌不仅能存活, 且能够被较轻浓度的石油烃刺激生长, 借助宿主植物的共生支持, 真菌活性增强, 但高浓度石油污染明显有抑制作用。接种筛选菌种后AM真菌和植物的兼容性好, AM真菌有更高繁殖率, 4种植物接种后平均孢子密度均明显高于未接种。可见在石油污染土壤修复过程中, AM真菌菌群是重要生物因素。
石油渗透污染易造成土壤黏结而降低其透水性, 石油污染使土壤总有机碳的含量显著增加, 抑制土壤脲酶活性, 土壤C/N/P的比率被改变[20], 植物生长受到抑制。但AM真菌土壤菌丝网络通过养分传递及再分配[21]能促进植物生长, 本研究接种AM菌剂明显促进了宿主植物的生物量, 接种后植物株高平均增加16.77%, 植物干重平均增加了22.56%, 王丽萍等[12]研究也证明接种AM真菌能促进植物生长和根系发育, 因此 AM真菌菌剂对污染土壤的修复有积极作用。
植物根围接种AM真菌后, 石油烃降解率平均增加15.35%, 说明接种AM真菌强化了植物修复作用。4种植物的降解率最高值与孢子密度最大值均出现在5000~10000 mg/kg范围, 说明AM真菌-植物修复更适宜小于10000 mg/kg石油烃浓度。植物根系接种AM真菌促进了土壤中石油类污染物的降解, Jussi等[22]的假说认为:石油烃污染的土壤中易利用的富碳基质, 促进了菌群利用碳源的能力, 从而驱动污染土壤中矿物油的降解。再者AM真菌可以分泌一些氧化酶类物质, 提高土壤中多酚氧化酶、过氧化酶等的活性, 进而促进土壤中有机污染物的降解[23]。另外, 菌根的形成可以改善根际微环境, 促进根围微生物的活性而加速土壤污染物降解[24]。
不同植物本身生物学差异明显, 综合比较接种后4种研究植物, 柠条的石油烃降解率在各浓度中均为最佳, 艾蒿的降解率不显著突出, 但生长良好有较强耐受力, 即使在40000 mg/kg的浓度中也无枯萎死苗现象。因此陕北轻壤黄绵土中柠条-地球囊霉和艾蒿-地球囊霉是值得深入研究的材料组合。
The authors have declared that no competing interests exist.
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