单宁酸、对羟基苯甲酸、鞣花酸、丁香酸和芦丁均购自BBI LIFE SCIENCES, 纯度均> 98%。体外发酵试验于2017年6月至10月在新疆农业大学动物营养实验室中进行。植物酚酸或芦丁添加量为0、0.05%、0.10%和0.20%(w/v)共4个水平, 每个处理3个重复。体外发酵采用ANKOMRF体外产气系统进行。发酵底物0.50 g, 精粗比为65∶ 35, 组成为粉碎玉米0.195 g、豆粕0.130 g、玉米秸秆0.175 g。人工唾液的配置参考Goering等^[6]的配方配制。瘤胃液采集前24 h配制缓冲液, 充分通入CO₂, 置于39.5 ℃水浴摇床, 过夜。采集新鲜瘤胃液, 经4层纱布过滤, 与人工唾液按照1∶ 4的比例混合均匀, 继续通入CO₂直至红色褪去后, 每个培养瓶分装200 mL, 39.5 ℃厌氧培养48 h。

采用Gas Pressure Monitor软件记录体外发酵产生的气体。发酵至24 h时利用集气袋收集气体, 以甲烷标准气体为外标, 采用气相色谱法测定发酵气体中的甲烷; 色谱条件为进样口170 ℃, 柱温箱40 ℃, 保持2 min, FID检测器200 ℃。待发酵48 h后, 将培养瓶放入冰水中以终止发酵, 并测定发酵终点pH值。NH₃-N采用靛酚蓝比色法测定。以4-甲基戊酸为内标, 采用气相色谱法测定发酵培养基中的挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA); 色谱条件为进样口230 ℃, 柱温箱起始温度55 ℃, 以13 ℃· min^-1升温到200 ℃后保持0.5 min, FID检测器240 ℃。

采用Excel 2007软件处理原始数据, 统计分析采用SPSS 18.0统计软件中的“ 一般线性模型” 进行, 同时分析添加酚化合物的线性和二次效应, 多重比较采用Duncan’ s新复极差法进行。

由表1可知, 添加单宁酸对产甲烷无显著影响(P> 0.05); 增加单宁酸添加水平显著降低发酵终点pH和NH₃-N浓度(P< 0.05), 并显著增加24和48 h累积产气量(GP₂₄、GP₄₈)(P< 0.05)。随着单宁酸水平的增加, pH呈显著的线性降低(P< 0.05), NH₃-N浓度呈显著的线性和二次降低(P< 0.05), 但GP₂₄和GP₄₈线性升高(P< 0.05)。当添加水平达到0.20%时, pH和GP₄₈分别显著低于和高于其他各组; 与对照组(Ⅰ 组)相比, 添加单宁酸后均显著降低NH₃-N浓度。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 添加植物酚酸及芦丁对体外发酵后pH、NH3-N、累积产气量及产甲烷的影响 Table 1 Effects of phenolic acids and rutin on pH, NH3-N, cumulative gas production and methane production in in vitro fermentation 酚化合物 Phenolics 指标 Index 组别(添加量) Group (dose) SEM P值 P value Ⅰ (0%) Ⅱ (0.05%) Ⅲ (0.10%) Ⅳ (0.20%) M L Q 单宁酸Tannic acid pH 6.68a 6.65ab 6.63b 6.56c 0.02 < 0.001 < 0.001 0.371 NH3-N (mmol· L-1) 33.33a 26.92b 25.90b 24.34c 0.72 < 0.001 < 0.001 < 0.001 GP24 (mL) 17.97c 18.39bc 22.43ab 22.92a 0.83 0.045 0.008 0.980 GP48 (mL) 29.79b 32.82b 35.76b 47.40a 2.04 0.001 < 0.001 0.154 甲烷CH4 (mmol· L-1) 4.44 4.57 4.53 4.31 0.18 0.976 0.786 0.721 对羟基苯甲酸 p-Hydroxybenzoic acid pH 6.94 7.02 6.97 6.97 0.01 0.133 0.650 0.102 NH3-N (mmol· L-1) 32.57a 31.93a 30.72b 30.39b 0.68 0.002 < 0.001 0.708 GP24 (mL) 26.70c 30.21b 33.91a 34.99a 1.67 0.005 0.001 0.668 GP48 (mL) 38.48 41.18 45.90 45.76 1.58 0.051 0.010 0.610 甲烷CH4 (mmol· L-1) 6.21 6.14 6.39 6.63 0.39 0.875 0.368 0.969 鞣花酸Ellagic acid pH 6.99a 6.98a 6.99a 6.95b 0.01 0.001 0.001 0.007 NH3-N (mmol· L-1) 25.70a 25.75a 24.62ab 23.51b 0.33 0.015 0.003 0.275 GP24 (mL) 16.66 18.29 18.29 20.12 0.58 0.072 0.015 0.791 GP48 (mL) 22.35 22.00 21.00 24.32 0.77 0.203 0.200 0.321 甲烷CH4 (mmol· L-1) 7.72a 5.17b 5.25b 5.82b 0.57 0.004 0.033 0.002 丁香酸Syringic acid pH 6.93 6.92 6.91 6.89 0.01 0.262 0.076 0.425 NH3-N (mmol· L-1) 26.29a 24.53b 24.42b 24.26b 0.33 0.001 < 0.001 0.027 GP24 (mL) 21.36b 20.46b 22.72ab 25.29a 1.62 < 0.001 < 0.001 0.713 GP48 (mL) 30.20c 35.67bc 39.57b 48.28a 1.78 < 0.001 < 0.001 0.709 甲烷CH4 (mmol· L-1) 4.84b 5.85ab 6.40a 6.36a 0.23 0.034 0.007 0.177 芦丁Rutin pH 7.24a 7.27a 7.22a 7.05b 0.08 < 0.001 < 0.001 0.001 NH3-N (mmol· L-1) 33.38a 31.26b 30.94b 28.51c 0.87 0.001 < 0.001 0.834 GP24 (mL) 34.84d 42.02c 50.07b 77.07a 3.86 < 0.001 < 0.001 < 0.001 GP48 (mL) 43.49d 53.99c 63.48b 93.14a 5.13 < 0.001 < 0.001 0.001 甲烷CH4 (mmol· L-1) 7.77 7.83 7.86 7.55 0.23 0.958 0.884 0.629 Note:In the same row, values with no letter meant no significant difference (P> 0.05), while with different small letter meant significant difference (P< 0.05). M: Main effect; L: Linear effect; Q: Quadratic effect. The same below. 注:同行无字母表示差异不显著(P> 0.05), 不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。M: 主效应; L: 线性效应; Q: 二次效应。下同。

表1 添加植物酚酸及芦丁对体外发酵后pH、NH3-N、累积产气量及产甲烷的影响 Table 1 Effects of phenolic acids and rutin on pH, NH3-N, cumulative gas production and methane production in in vitro fermentation

添加对羟基苯甲酸对pH、GP₄₈和产甲烷无显著影响(P> 0.05); 与对照组相比, 添加剂量达到0.10%和0.20%时, 使NH₃-N浓度显著降低(P< 0.05), 而GP₂₄显著升高(P< 0.05)。随着对羟基苯甲酸水平的增加, 线性降低NH₃-N浓度(P< 0.05), GP₂₄和GP₄₈线性升高(P< 0.05)。

与对照组相比, 当鞣花酸添加水平达到0.20%时, pH和NH₃-N显著降低, 虽然GP₂₄有增加的趋势, 但各组间无显著差异(P> 0.05)。添加鞣花酸后, 甲烷浓度显著降低, 与对照组相比, Ⅱ 、Ⅲ 和Ⅳ 组分别降低33.03%、31.99%和24.61%(P< 0.05)。随着鞣花酸水平的增加, pH和甲烷浓度呈显著的线性和二次降低(P< 0.05), 并线性升高GP₂₄, 降低NH₃-N浓度(P< 0.05)。

添加丁香酸对pH无显著影响(P> 0.05), NH₃-N显著降低(P< 0.05), 而GP₂₄和GP₄₈显著升高(P< 0.05)。与对照组相比, 当丁香酸添加水平达到0.10%和0.20%时, 甲烷浓度提高了32.23%和31.40%(P< 0.05)。随着丁香酸水平的增加, NH₃-N浓度呈显著的线性和二次降低(P< 0.05), GP₂₄、GP₄₈和甲烷浓度线性升高(P< 0.05)。

添加芦丁对甲烷无显著影响(P> 0.05)。与对照组相比, 添加0.20%的芦丁使pH显著下降、GP₂₄和GP₄₈显著升高(P< 0.05); 添加0.05%~0.20%的芦丁使NH₃-N显著下降(P< 0.05)。随着芦丁水平的增加, 线性和二次降低pH(P< 0.05), 升高GP₂₄和GP₄₈(P< 0.05), NH₃-N浓度呈显著的线性降低(P< 0.05)。

由表2可知, 添加单宁酸对乙酸、丙酸和TVFA(总挥发性脂肪酸, total volatile fatty acids)无显著影响(P> 0.05), 随着单宁酸水平的增加, 乙酸呈线性增加趋势(P=0.083), 异丁酸和异戊酸呈显著的线性和二次降低(P< 0.05), 丁酸和戊酸线性降低(P< 0.05), 而乙丙比呈线性升高(P< 0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 添加植物酚酸及芦丁对体外发酵VFA的影响 Table 2 Effects of phenolic acids and rutin on VFA in in vitro fermentation (mmol· L-1) 酚化合物 Phenolics 指标 Index 组别(添加量) Group (dose) SEM P值 P value Ⅰ (0%) Ⅱ (0.05%) Ⅲ (0.10%) Ⅳ (0.20%) M L Q 单宁酸Tannic acid 乙酸 Acetate 33.56 32.63 34.53 36.34 0.65 0.223 0.083 0.290 丙酸 Propionate 8.71 8.95 8.74 8.53 0.14 0.466 0.366 0.232 异丁酸 Isobutyrate 0.54a 0.41b 0.37c 0.34d 0.01 < 0.001 < 0.001 < 0.001 丁酸 Butyrate 3.54a 3.16b 3.06b 2.96b 0.06 < 0.001 < 0.001 0.067 异戊酸 Isovalerate 1.13a 0.85b 0.77c 0.72c 0.03 < 0.001 < 0.001 < 0.001 戊酸 Valerate 2.69a 2.29b 2.05bc 1.75c 0.09 < 0.001 < 0.001 0.658 总挥发性脂肪酸TVFA 50.18 48.28 49.52 50.64 0.67 0.660 0.678 0.289 乙丙比 C2/C3 3.89ab 3.66b 3.96ab 4.31a 0.10 0.046 0.030 0.076 对羟基苯甲酸 p-hydroxybenzoic acid 乙酸 Acetate 23.45a 23.65a 21.25b 21.69ab 0.37 0.037 0.017 0.863 丙酸 Propionate 8.37 8.60 7.81 7.93 0.35 0.198 0.286 0.842 异丁酸 Isobutyrate 0.78 0.78 0.77 0.76 0.05 0.732 0.344 0.751 丁酸 Butyrate 3.70 3.69 3.58 3.97 0.17 0.534 0.414 0.307 异戊酸 Isovalerate 1.64 1.61 1.64 1.70 0.14 0.850 0.537 0.534 戊酸 Valerate 2.47 2.50 2.55 2.63 0.12 0.556 0.166 0.758 总挥发性脂肪酸TVFA 40.40 40.83 37.60 38.67 0.62 0.214 0.126 0.789 乙丙比 C2/C3 2.92 2.89 2.85 2.89 0.11 0.707 0.509 0.408 鞣花酸Ellagic acid 乙酸 Acetate 25.82a 24.96ab 23.98b 23.97b 0.33 0.003 < 0.001 0.248 丙酸 Propionate 6.43 6.60 6.35 6.32 0.07 0.288 0.232 0.366 异丁酸 Isobutyrate 0.84a 0.80b 0.76b 0.77b 0.01 < 0.001 < 0.001 0.029 丁酸 Butyrate 3.48a 3.31ab 3.21b 3.22b 0.10 0.020 0.005 0.171 异戊酸 Isovalerate 1.63 1.70 1.50 1.56 0.04 0.068 0.095 0.892 戊酸 Valerate 1.51a 1.45ab 1.42b 1.41b 0.01 0.037 0.006 0.328 总挥发性脂肪酸TVFA 39.70a 38.82a 37.22b 37.25b 0.48 0.005 0.001 0.391 乙丙比 C2/C3 4.02a 3.78b 3.77b 3.80b 0.03 0.011 0.013 0.024 丁香酸Syringic acid 乙酸 Acetate 30.17 30.15 31.97 31.98 0.80 0.057 0.015 0.977 丙酸 Propionate 5.87ab 5.77b 6.00a 5.88ab 0.07 0.049 0.291 0.900 异丁酸 Isobutyrate 0.50 0.49 0.50 0.49 0.01 0.136 0.084 0.131 丁酸 Butyrate 3.02 3.14 3.43 3.23 0.07 0.071 0.067 0.142 异戊酸 Isovalerate 1.04 0.99 1.04 0.98 0.02 0.062 0.164 0.691 戊酸 Valerate 2.58 2.56 2.54 2.48 0.02 0.127 0.027 0.413 总挥发性脂肪酸TVFA 43.18b 43.11b 45.48a 45.04ab 0.95 0.043 0.017 0.799 乙丙比 C2/C3 5.11 5.19 5.31 5.42 0.09 0.210 0.037 0.910 芦丁Rutin 乙酸 Acetate 24.55c 26.89bc 28.52b 31.37a 0.85 < 0.001 < 0.001 0.758 丙酸 Propionate 7.37c 9.19b 10.58ab 11.61a 0.47 < 0.001 < 0.001 0.443 异丁酸 Isobutyrate 0.74 0.89 0.85 0.83 0.03 0.078 0.185 0.046 丁酸 Butyrate 4.10b 4.80ab 5.10ab 5.51a 0.31 0.041 0.005 0.660 异戊酸 Isovalerate 1.47b 2.06a 2.12a 1.98a 0.09 < 0.001 < 0.001 < 0.001 戊酸 Valerate 1.49 1.50 1.19 1.32 0.06 0.157 0.104 0.594 总挥发性脂肪酸TVFA 39.72c 45.32b 48.36ab 52.62a 1.67 < 0.001 < 0.001 0.662 乙丙比 C2/C3 3.42a 2.97ab 2.73b 2.80b 0.10 0.048 0.014 0.163 TVFA:Total volatile fatty acids.

表2 添加植物酚酸及芦丁对体外发酵VFA的影响 Table 2 Effects of phenolic acids and rutin on VFA in in vitro fermentation (mmol· L-1)

对羟基苯甲酸对瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸的影响较小, 当添加水平为0.10%时, 乙酸显著低于对照组(Ⅰ 组)和0.05%组(Ⅱ 组)(P< 0.05), 其他挥发性脂肪酸、TVFA和乙丙比在各组间均无显著差异(P> 0.05)。随着对羟基苯甲酸水平的增加, 乙酸呈显著的线性降低(P< 0.05)。

添加不同水平鞣花酸对丙酸和异戊酸无显著影响(P> 0.05), 随着鞣花酸水平的增加, 乙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、TVFA和乙丙比呈显著的线性降低(P< 0.05)。当鞣花酸添加水平达到0.10%后, 丁酸、戊酸和TVFA均显著下降; 当添加水平达到0.05%后, 异丁酸水平和乙丙比均显著下降(P< 0.05)。

除丙酸和TVFA外, 添加丁香酸对其他VFA及乙丙比无显著影响(P> 0.05)。添加0.10%的丁香酸后, 与0.05%组(Ⅱ 组)相比, 丙酸显著增加; 另外, 第Ⅲ 组TVFA较Ⅰ 和Ⅱ 组也明显增加(P< 0.05)。随着丁香酸水平的增加, 乙酸、TVFA和乙丙比呈显著的线性增加(P< 0.05)。

添加芦丁对异丁酸和戊酸无显著影响(P> 0.05), 但使其他VFA水平均有显著升高(P< 0.05)。当芦丁添加剂量达到0.05%后, 丙酸、异戊酸和TVFA水平显著增加; 当添加剂量达到0.10%后, 乙酸显著增加而乙丙比显著下降(P< 0.05); 当添加剂量达到0.20%时, 丁酸显著增加(P< 0.05)。随着芦丁水平的增加, 乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA呈显著的线性增加(P< 0.05), 而乙丙比线性降低(P< 0.05)。

单宁酸(又称单宁)是一种广泛存在于植物体内的多元酚类化合物, 相对分子量为500~3000 Da, 根据其结构特征分为可水解单宁和缩合单宁。无论是水解单宁还是缩合单宁, 对瘤胃发酵均具有调控作用。本研究中使用的是可水解单宁, 相对分子量为1700 Da。研究表明, 添加单宁酸后具有降低氨态氮的作用^[7], 在本研究中也得到进一步证实。单宁可通过与饲粮蛋白质形成难以消化的复合物并降低消化酶的活性等方式降低蛋白质在瘤胃中的分解。Min等^[8]研究表明, 百脉根(Lotus corniculatus)缩合单宁可降低瘤胃微生物对蛋白质的降解速度, 同时抑制部分蛋白质降解菌的生长。这可能是导致氨态氮下降的根本原因。

通常认为单宁酸对瘤胃微生物的生长有抑制作用。从现有研究可以看出, 这种抑制作用与单宁酸的添加水平有密切关系。但Yuliana等^[1]在体外培养条件下添加0.5~1.0 mg· mL^-1来源于Swietenia mahagony的单宁酸对体外产气、DMD(degradability of dry matter, 干物质降解率)、OMD(degradability of organic matter, 有机物降解率)、NH₃-N、细菌和原虫无显著影响, 说明0.5~1.0 mg· mL^-1的单宁酸对瘤胃发酵无显著影响。本研究也发现, 添加0.05%~0.10%的单宁酸时, 对发酵无显著影响。当添加水平增加到0.20%时, 才显著增加体外产气量。这提示, 添加低水平单宁并不改变瘤胃发酵, 增加单宁添加水平后产气量的增加与瘤胃微生物区系的变化有关。研究发现, 当单宁酸添加水平为底物干物质的1%和2%时可以增加绵羊瘤胃纤维降解菌数量, 并降低产甲烷菌的数量^[9]。

无论是缩合单宁还是水解单宁均具有降低甲烷产生的作用。然而在本研究中, 添加0.05%~0.20%单宁酸并不影响甲烷的产生, 这可能与单宁的添加水平、分子结构和相对分子量有关。由于单宁不是一种分子, 种类繁多, 结构各异, 对于瘤胃微生物甲烷排放的作用效果受到单宁来源、形式和水平的影响。研究表明, 可水解单宁和缩合单宁混合使用抑制甲烷菌数比单独使用更有潜力。单宁通过直接抑制甲烷菌或降低原虫的数量两个途径减少甲烷生物合成^[10]。瘤胃内产甲烷细菌与原虫是互利共生的, 大部分的产甲烷细菌附着在原虫表面, 将原虫代谢过程中产生的大量氢气用于合成甲烷, 原虫的减少导致氢气产量减少, 从而进一步导致甲烷产量下降^[11]。另外, 单宁的分子量也是影响甲烷产生的因素之一。Saminathan等^[12]报道, 给反刍动物饲喂从新银合欢(Leucaena leucocephala)中提取的不同分子质量的缩合丹宁均会降低甲烷产量, 并且分子质量越大, 影响越显著。还有, 单宁的结构也影响其抑制甲烷的能力, 如白坚木(Loxopterygium lorentii)、橡豌、葡萄籽来源的单宁显著降低甲烷生成, 而来源于秘鲁树荚、板栗、绿茶的单宁对瘤胃甲烷生成影响不显著^[13]。有关单宁结构与抑制甲烷生成的活力之间的关系目前还不清楚。

张辉^[14]发现, 体外培养条件下, 当对羟基苯甲酸添加水平为30~120 mg· g^-1底物时, 随着添加水平的增加, 72 h累计产气量有线性降低的趋势, 产气速度显著下降。然而在本研究中, 添加对羟基苯甲酸后GP₂₄和GP₄₈均显著增加。产气量的变化与瘤胃微生物, 特别是纤维降解菌降解纤维的能力有关。Borneman等^[15]发现, 添加5和10 mmol· L^-1对羟基苯甲酸可以刺激纤维分解菌生长及生黄瘤胃球菌降解纤维的作用。但是Chesson等^[16]发现, 5 mmol· L^-1以上对羟基苯甲酸使产琥珀酸丝状杆菌和生黄瘤胃球菌的纤维消化程度或纤维降解活性持续降低, 而白色瘤胃球菌不受其影响。由此可见, 对羟基苯甲酸对瘤胃微生物的影响还需进一步研究。

与其他添加水平相比, 对羟基苯甲酸添加水平为60 mg· g^-1时氨态氮显著下降; 总挥发性脂肪酸浓度随对羟基苯甲酸浓度的增加呈显著线性下降^[14]。在本研究中, 当对羟基苯甲酸添加水平达到0.10%时, 氨态氮显著下降, 乙酸明显下降, 但总挥发性脂肪酸并无显著差异。对羟基苯甲酸对蛋白质降解的影响可能与其他植物酚类化合物相似, 抑制了蛋白质在瘤胃中的降解, 致使氨态氮水平降低。

到目前为止, 尚未见有关对羟基苯甲酸对瘤胃产甲烷菌影响的报道。在本研究中, 添加对羟基苯甲酸对混合瘤胃微生物的甲烷产生无显著影响。因此推测, 对羟基苯甲酸对瘤胃产甲烷菌无抑制作用。

研究发现, 鞣花酸具有抑制瘤胃真菌Neocallimastix frontalis纤维素酶活性的作用, 并且其作用明显强于单宁^[17]。鞣花酸对瘤胃中其他酶类活性有何影响, 尚不清楚。在本研究中, 当鞣花酸添加水平达到0.20%时, 发酵终点pH、氨态氮、挥发性脂肪酸均下降; 特别是添加鞣花酸后, 甲烷下降明显。这可能与鞣花酸的抑菌作用有关。

Borneman等^[15]认为, 在纯培养条件下添加5和10 mmol· L^-1丁香酸可提高纤维素降解菌和半纤维素降解菌的生长, 在添加量达10 mmol· L^-1时显著提高生黄瘤胃球菌降解滤纸的能力; 但是当以纯纤维素为底物时, 在混合瘤胃微生物中添加10 mmol· L^-1的丁香酸后, 纤维素的干物质降解率反而显著下降。这可能是由于丁香酸被混合瘤胃微生物中的非纤维降解菌代谢而未能发挥期促生长作用^[15]。当以草原干草为底物, 1.0 mmol· L^-1 对羟基苯甲酸与酵母可提高瘤胃微生物体外产气和底物干物质降解率, 而丁香酸仅提高体外产气量, 对底物干物质降解率无显著影响^[18]。在本试验中, 底物精粗比为65∶ 35, 当丁香酸添加水平达到0.10%时, GP₂₄、GP₄₈、甲烷、总挥发性脂肪酸和丙酸均有不同程度增加。这表明, 丁香酸对体外发酵的影响可能与底物类型有关。

芦丁属多酚黄酮类化合物, Oskoueian等^[4]在粗料型(6∶ 4)底物中添加4.5%(底物干物质基础)的芦丁后显著抑制甲烷产生, 但对产甲烷菌数量无显著影响。甲烷的降低可能与瘤胃微生物区系的变化及碳水化合物水解酶活性降低有关^[4]。然而, 在本研究中, 向精料型底物添加0.05%~0.20%的芦丁并未降低甲烷的产生, 与上述研究结论截然相反。另外, 本研究还发现, 添加芦丁可显著增加挥发性脂肪酸浓度, 特别是在高浓度时, 作用更为明显。郭旭东等^[19]报道, 在瘤胃液中添加芦丁可提高瘤胃内容物碳水化合物水解酶活性, 这有利于加快纤维性物质在瘤胃内的降解, 提高粗纤维的利用率。Cui等^[20]在奶牛饲粮中添加3.0 mg· kg^-1饲粮的芦丁, 瘤胃pH有降低的趋势, 氨态氮明显降低, TVFA和微生物总蛋白质明显升高。本研究结果与此基本一致。