羊草种子萌发相关基因的筛选及表达分析

引用本文

刘书, 刘盼盼, 杨伟光, 齐冬梅, 李晓霞, 刘公社. 羊草种子萌发相关基因的筛选及表达分析. 草业学报, 2018,27(11): 58-66
LIU Shu, LIU Pan-pan, YANG Wei-guang, QI Dong-mei, LI Xiao-xia, LIU Gong-she. The identification and expression analysis of genes related to seed germination in Leymus chinensis . Acta Prataculturae Sinica,2018,27(11): 58-66 复制到剪切板

Doi:10.11686/cyxb2017502
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本文属于开放获取期刊。

羊草种子萌发相关基因的筛选及表达分析

刘书^1,^2*,^*, 刘盼盼^1,^2*,^*, 杨伟光^1,^2,³, 齐冬梅¹, 李晓霞^1,^*, 刘公社^1,^*

1.中国科学院植物研究所,北京 100093

2.中国科学院大学,北京 100049

3.黑龙江省畜牧研究所,黑龙江齐齐哈尔 161005

*通信作者Corresponding author. E-mail: liugs@ibcas.ac.cn, lixx2013@ibcas.ac.cn

作者简介:刘书(1993-),男,山西大同人,在读硕士。E-mail: liushu15@mails.ucas.ac.cn; 刘盼盼(1990-),女,河南周口人,硕士。E-mail: a947148754@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

收稿日期: 2017-12-13

基金项目:牧草种质资源保护项目(2130135)和973项目(2014CB138704)资助

摘要

前期实验表明,变温处理(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)可显著提高羊草种子的萌发率,且羊草种子萌发中的第1天是接受变温信号的关键时期。以此为研究基础,结合羊草种子变温萌发的转录组测序数据,针对羊草种子萌发初期对变温处理的响应筛选出与种子萌发、休眠及低温相关的基因24个,利用测序结果中这些基因的RPKM值制作基因表达热图并分析其表达差异。以萌发率高、低的两种羊草种质的种子为材料,对24个基因在恒温12 h(28 ℃)和变温1 d(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)萌发处理中的表达分别进行了定量分析。结果表明,与恒温对照相比,变温处理12 h后,表达明显上调的基因有 SAIN1, PP2 C62, EXPB3, EXPB4, GA3 ox, EXPA2和 EXPA7,而表达明显下调的基因有 bHLH49, GID1, ABI8, Chi1,11833, CBF3, NAC2, PP2 C72, SAIN2和5423。通过进一步分析相关基因在高、低萌发率两个种质中表达的差异,筛选出其中可能与羊草种子萌发相关的基因有几丁质酶基因 Chi1,转录因子基因 CBF3,羊草新基因5423,赤霉素合成基因 GA3 ox,细胞松弛素蛋白基因 EXPB4和羊草新基因 SAIN1,将为下一步阐明羊草种子萌发的分子作用机理奠定基础。

关键词: 羊草; 种子萌发; 变温; 基因表达

The identification and expression analysis of genes related to seed germination in Leymus chinensis

LIU Shu^1,^2,^**, LIU Pan-pan^1,^2,^**, YANG Wei-guang^1,^2,³, QI Dong-mei¹, LI Xiao-xia^1,^*, LIU Gong-she^1,^*

1.Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China

2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

3.Institute of Animal Sciences in Heilongjiang Province, Qiqihar 161005, China

Abstract

Previous studies have suggested that the variable temperature (28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h) can significantly increase the germination rate of Leymus chinensis seed, and that the first day of germination was key for responses to variable temperature. A transcriptome analysis of L. chinensis seed germination under variable temperature treatment was performed. Based on sequencing, 24 genes related to seed germination, low temperature and dormancy were selected for heat map analysis using the reads per kilo base per million mapped reads (RPKM) value. In addition, under the treatment of constant temperature (28 ℃) for 12 h and variable temperature (28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h) for 1 d, the relative expression of the selected genes in two L. chinensis genotypes (high and low germination rate) were quantified by qRT-PCR. Our results indicated that the expression of SAIN1, PP2 C62, EXPB3, EXPB4, GA3 ox, EXPA2 and EXPA7 were significantly up-regulated in the seeds treated at 16 ℃ for 12 h, while the expression of bHLH49, GID1, ABI8, Chi1, 11833, CBF3, NAC2, PP2 C72, SAIN2 and 5423 were significantly down-regulated, compared with the constant temperature (28 ℃) control. Further analysis of the gene expression in the two genotypes suggested that Chi1, CBF3, GA3 ox, EXPB4, 5423 and SAIN1 were the putative genes related to germination in L. chinensis.This research may lay the foundation for further studies on the molecular mechanisms in seed germination of L. chinensis.

Keyword: Leymus chinensis; seed germination; variable temperature treatment; gene expression

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种子的萌发需要适宜的温度条件, 有些植物种子的萌发需要变化的温度^[1]。种子的活力和相关代谢对温度信号的响应是萌发的关键, 温度能够直接影响种子萌发或间接地通过调节种子休眠以影响种子萌发。种子在开始萌发的过程中, 低温信号可导致种子内部激素含量的变化, 调控种子萌发^[2]; 温度的变化也能够影响种子休眠, 较高的环境温度中种子休眠度深, 而低温对于种子破除休眠有着非常关键的作用^[3]。

种子萌发调控中, 激素之间的协同和拮抗有重要作用^[4]。ABA与GA是关键的两种萌发调控激素, 其各自的合成与代谢形成的种子内激素含量的平衡决定种子的生理状态, 以温度为代表的环境信号通过一系列信号转导途径作用于激素的合成代谢途径, 导致激素含量的变化, 从而影响种子的萌发^[5]。在植物体内, GA和ABA的合成代谢基因及信号转导相关基因已被大量鉴定。GA促进种子萌发的过程中, 调控GA合成的关键基因是GA3ox1和GA3ox2^[6], 而GA2ox调控GA的降解, GID1是GA信号通路中的关键基因^[7]。ABA抑制萌发, 拮抗GA的促进作用^{[8, 9]}, 玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase, ZEP)和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxy-carotenoid oxygenase, NCED)是ABA合成途径中的两个关键酶, 而CYP707A2是ABA降解的关键基因^{[10, 11]}, PP2Cs在ABA信号转导中有重要作用^[12]。有研究表明, 低温能上调GA合成代谢基因(AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA3ox1)和下调GA分解代谢基因(AtGA2ox2), 从而提高种子内活性GA的含量, 进而促进萌发^[13]。高温使ABA合成相关基因NCED2, NCED5和NCED9的表达上调, 导致ABA水平上升, 并抑制GA合成途径基因的表达, 使种子萌发受到抑制^{[14, 15]}。此外, 细胞壁松弛蛋白能够软化胚乳组织, 促进细胞壁解聚, 帮助胚根伸出^[16]。已有研究表明细胞壁松弛蛋白编码基因EXPA1, EXPA2, EXPA3, EXPA8, EXPA9和EXPA20等在吸涨的种子中表达量显著提高, 因此细胞壁松弛蛋白在促进种子萌发中有着非常重要的作用^{[17, 18]}。

羊草(Leymus chinensis)是我国重要的禾本科牧草^[19], 应用价值高, 但种子萌发率偏低限制了羊草种子的生产应用^[20]。已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发, 而恒温不利于其萌发^{[21, 22, 23, 24, 25, 26, 27]}; 并且本实验室已对羊草种子的萌发条件进行了大量实验, 发现相较恒温28 ℃条件, 变温(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)可显著提高羊草种子萌发率。本研究在确定羊草种子响应变温信号敏感期的基础上, 结合前期变温处理羊草种子萌发的转录组测序数据, 对初选的24个可能与种子萌发、休眠及低温响应与激素代谢等相关的基因进行定量分析, 筛选出与变温萌发有关的关键基因, 并对其在种子萌发初期的表达进行了初步分析, 旨在为羊草种子萌发早期的分子机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用的羊草种质为SF2-1和XQ10-1, 本研究组前期研究已表明其萌发率存在显著差异。羊草材料均种植于中国科学院植物研究所(北京)羊草种质资源圃, 在自然条件下生长, 于2014年收获种子供试。

1.2 实验方法

1.2.1 羊草种子萌发不同时段变温处理取直径9 cm铺有浸湿滤纸的玻璃平皿, 将人工挑选的50粒饱满种子均匀地排列在滤纸上, 平皿中加入5 mL蒸馏水使滤纸充分吸水湿润, 4次重复。将皿盖倾斜45° 盖于平皿上, 平皿和皿盖一起放入托盘内, 托盘内倒入1 cm深的蒸馏水。将托盘放入人工气候箱(相对湿度65%)。对处于28 ℃恒温条件下进行萌发的SF2-1和XQ10-1种子, 在不同的时间段(第0~12 h、12~24 h、24~36 h、36~48 h、48~60 h、60~72 h)以16 ℃低温处理12 h后, 继续放入恒温培养箱中萌发12 d。以持续处于恒温28 ℃条件下萌发的种子作为对照, 测定各处理中最终的种子萌发率(变温处理后的第12天), 4次重复。发芽标准为胚根伸出1 mm。

1.2.2 羊草种子总RNA提取与cDNA合成以1.2.1的羊草种子萌发的方法, 取恒温(28 ℃)1 d和变温(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)处理1 d后的羊草种子, 用滤纸吸干种子表面水分, 液氮处理后, 保存于-80 ℃超低温冰箱备用。

采用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)分别提取各温度处理的羊草种子中的总RNA, 利用DNase I (TIANGEN)消化基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性, 并使用Biodropsis BD-2000测定RNA浓度和纯度。使用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time 编号:RR037Q)进行cDNA合成, 反应体系为10 μ L:5× PrimeScript^® Buffer(2 μ L), PrimeScript^® RT Enzyme Mix I(0.5 μ L), OligodT Primer(50 μ mol· L^-1)(0.5 μ L), Random 6 mers(100 μ mol· L^-1)(0.5 μ L), Total RNA(500 ng), RNase-Free ddH₂O(补足至10 μ L)。反转录反应条件为:37 ℃, 15 min; 85 ℃, 5 s。合成后的cDNA存贮于-20 ℃冰箱备用。

1.2.3 羊草种子萌发变温处理转录组测序前期研究组选取萌发率较高的羊草种质SF2-1的种子, 以恒温(28 ℃)12 h萌发的种子作为对照组, 变温(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)1 d和恒温(28 ℃)24 h萌发种子作为实验组, 进行转录组测序, 并对转录组测序数据深度分析。

结合转录组数据的初步分析结果, 筛选与高等植物种子萌发过程中的生理变化和激素代谢, 以及与低温响应相关的24个候选基因(表1), 并以转录组测序数据中这24个基因在不同温度条件下的RPKM值利用R语言制作基因表达热图。

表1 候选基因及其定量引物序列 Table 1 Selected genes and the primers used in qRT-PCR

序号 Number	基因 Gene	功能或来源 Function or reference	引物 Primers
1	11833	羊草新基因 A novel gene in L. chinensis	S: ACTGGTGTTGGATGATGAGCG; A: CGGGAGGAAAGATAGAGGTCG
2	SAIN1	羊草新基因 A novel gene in L. chinensis	S: GTTTCTGCCTGATTGGTTTCCC; A: ATGTCGTGGCTGTCGTTTGTCC
3	SAIN2	羊草新基因 A novel gene in L. chinensis	S: AGGAGATGGGAGGATGACGGAT; A: CATGACAGCAAGAAGAGAGGAAAG
4	5423	羊草新基因 A novel gene in L. chinensis	S: GCCGTCGTCATCTACTTCGTCT; A: GATTCTCACTCCTTGCTCCCC
5	CBF3	转录因子 Transcription factor CBF	S: AGTCGTCCTCTTCCCCAGCG; A: CGTAGTACAGGTCCCAGCCCAT
6	NAC2	转录因子 Transcription factor NAC	S: GCAGCAGCAGGAGGGGGATA; A: TTGGGCACCATGAGCGTC
7	bHLH49	转录因子 Transcription factor bHLH	S: TGGTGGTGCTGATGAGGAGG; A: CGACGCGGAAATGCGAAGT
8	SPATULA	转录因子 Transcription factor SPATULA	S: GGTGCACAACCTCTCCGAGA; A: GGCCGATACATGCCATTCC
9	EXPA2	α 类EXP家族基因 α -EXP gene	S: ACCATCACCGCCACCAACCT; A: TCCCGCCCTTCTTCACACAG
10	EXPA5	α 类EXP家族基因 α -EXP gene	S: CCACTCCTACTTCAACCTCGTCC; A: TGCTCTGCCAGTTCTGTCCC
11	EXPA7	α 类EXP家族基因 α -EXP gene	S: CCCAACCACCATTTCCTCCT; A: TTCACTGATCTGACATCGCCAG
12	EXPB3	β 类EXP家族基因 β -EXP gene	S: TCAGGTGGACATGAAGGAGGC; A: AACTGGACGAAGGAGCGGTAG
13	EXPB4	β 类EXP家族基因 β -EXP gene	S: TTCGCGGTGCTGGTGGAGTA; A: TGGCCGGGATGACCTTGTT
14	EXPB16	β 类EXP家族基因 β -EXP gene	S: CAGCACACTGGCAAGAAATGAA; A: AGCCTGACAGAGAATGGACCC
15	GA2ox	赤霉素氧化酶 Gibberellin 2-oxidase	S: CTGGCGGCACACGACAAGCA; A: CGTCGCCGTTGAAGCCGATG
16	GA3ox	赤霉素羟化酶 GA 3β -hydroxylase	S: GCCGCCCATCTCCTCCTACT; A: CGATCTTGTGCTCGGACTCCA
17	GID1	赤霉素受体GA INSENSITIVE DWARF1	S: TCCAGGACAGGGACTGGTACTG; A: TGATGAGGCTCTTGGCGAAAG
18	ABI8	脱落酸不敏感蛋白 ABA-INSENSITIVE8	S: TCCTCCCACGGCATCTCTCT; A: GCGGCTTCTGTCCTGTTGTTC
19	PYL8	脱落酸受体 ABA receptor	S: ACGGCAACACAAAGGATGAGA; A: GCGGCGATGTAGGTGACTGAA
20	ZEP	玉米黄质环氧化酶 Zeatin riboside	S: GAATTGCAGACTTTGTGCCTCC; A: CGACCTTTCCCCCAGTTGAT
21	Chi1	几丁质酶基因 Chitinase1	S: GCCAGTACGGCTATTGCGG; A: TTGAAGAACGCCTCGGTGAC
22	ROS1	活性氧簇 DNA glycosylase/lyase	S: TACCACGAGAAAGCGCAAAAA; A: CCGAATGAAACTCCTCAGAACAG
23	PP2C62	钙调蛋白磷酸酶 Protein phosphatase	S: GGGCCAGAAACAGGGAAAGG; A: CAAAGAGATGTGCACGCAGAAAG
24	PP2C72	钙调蛋白磷酸酶 Protein phosphatase	S: AACGGTCGTGGTGGTATTTTTT; A: GAATTTGCAGGGAGGGCAA
*	Actin	羊草内参基因 L. chinensis β -actin	S: GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT; A: CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC

表1 候选基因及其定量引物序列 Table 1 Selected genes and the primers used in qRT-PCR

1.2.4 基因表达定量分析根据转录组测序数据初步筛选的24个候选相关基因的CDS序列设计荧光定量引物, 以羊草Actin基因序列设计内参引物(表1), 以恒温处理为对照, 通过定量PCR(qRT-PCR)分析相关基因在高、低萌发率羊草种质于变温处理下萌发中的表达变化。定量PCR体系和条件按照TaKaRa公司SYBR^® Premix Ex Taq^TM II (TliRNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作。反应程序为:95 ℃, 30 s; 45个循环(95 ℃, 5 s; 68 ℃, 30 s)。技术重复3次。定量PCR反应完成后, 采用2^{-Δ Δ Ct}方法对所得数据进行相对定量分析^[28]。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 17.0和Microsoft Excel 2010软件完成统计分析, 图表制作使用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0软件。采用单因素方差分析和LSD最小显著差异法检验不同变温时段羊草种子萌发率以及各基因相对表达量的差异性。使用R语言制作基因表达热图。

2 结果与分析

2.1 羊草种子萌发对不同时段变温处理的响应

为了探究羊草种子萌发过程中对变温信号的响应, 以12 h为梯度的变温处理萌发实验结果表明:与对照相比, 不论是高萌发率种质SF2-1, 还是低萌发率种质XQ10-1, 在萌发的第12 h之后的任何时段进行低温处理, 其萌发率均极显著(P< 0.01)提高, 表明羊草种子在萌发的第12 h已经开始响应变温信号。在低萌发率种质XQ10-1中对各低温处理时段的LSD分析表明, 第12~24 h进行低温处理的萌发率与恒温对照以及第0~12 h低温处理相比, 均有极显著提高(P< 0.01), 而在第12~24 h之后的12 h时段低温处理后的萌发率与第12~24 h处理相比差异不显著; 在高萌发率种质SF2-1中进行LSD分析, 在第12~24 h低温处理极显著地提高了萌发率, 但相比于第12~24 h, 在第24~36 h低温处理仍表现出萌发率的显著提高(P< 0.01), 且在各时段处理中的调高幅度最大。通过两个种质中不同时段低温处理后的萌发率差异可以得出, 第12~24 h是羊草种子响应低温信号的关键时段, 详见图1。

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图1 不同时段的变温处理对羊草种子萌发的影响Fig.1 The germination rate of two genotype seeds treated with 16 ℃ in different stage of germination in 28 ℃
SF2-1和XQ10-1分别进行LSD分析, 不同大写字母代表处理间在 P< 0.01水平上差异极显著。The LSD analysis was performed in L. chinensis genotypes SF2-1 and XQ10-1, respectively. The different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level within the treatments.

2.2 羊草种子萌发相关基因的筛选

依据羊草种子萌发不同时段变温处理实验结论“ 第12~24 h是羊草种子响应低温信号的关键时段” , 选取了高萌发率种质SF2-1的种子进行了变温处理转录组测序, 利用转录组数据分析得到的各基因的RPKM值, 对初步筛选的24个可能与羊草种子萌发、休眠及低温相关的基因进行热图分析, 得到不同温度条件下基因的差异表达情况(图2)。

结果表明:与恒温(28 ℃ 12 h)对照相比, 16 ℃低温处理12 h后, 表达明显上调的基因有SAIN1, PP2C62, EXPB3, EXPB4, GA3ox, EXPA2和EXPA7, 而表达明显下调的基因有bHLH49, GID1, ABI8, Chi1, 11833, CBF3, NAC2, PP2C72, SAIN2和5423。与恒温28 ℃ 12 h对照相比, 恒温28 ℃处理24 h后, 表达明显上调的基因有SAIN1, PP2C62, PYL8, GID8, ABI8, SPATULA和ROS1, 而表达明显下调的基因有GA2ox, ZEP, EXPA5, EXPB16, Chi1, 11833, CBF3, NAC2, PP2C72和5423。与对照相比, 两组不同的温度处理中, 表达均明显上调的基因有SAIN1, PP2C62和EXPB3, 而在两种温度处理中表达均明显下调的有Chi1, 11833, CBF3, NAC2, PP2C72和5423。

2.3 羊草种子变温萌发中相关基因的表达变化

以恒温处理为对照, 对各基因在变温处理后的SF2-1和XQ10-1羊草种子中的表达进行PCR荧光定量分析。结果表明:变温处理1 d后, 在两种材料中表达量都上调的基因有SAIN1, NAC2, EXPB4, EXPB16和EXPA2等5个。在萌发率高的SF2-1的材料中, 还有11个基因分别有不同程度上调(图3), 其中, EXPA2和PP2C72这两个基因的上调明显, 分别较对照上调13.7和9.0倍。而在萌发率低的XQ10-1的材料中, 仅有上述5个基因的表达量上调(图4)。在两个种质中均上调表达的5个基因中, SAIN1基因在SF2-1中上调较XQ10-1明显, 而其他4个基因在XQ10-1中的上调更加明显。

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	图2 羊草种子萌发相关基因表达热图Fig.2 The heat map of expression of the genes related to germination in L. chinensis

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	图3 SF2-1种子变温处理后上调基因Fig.3 The up-regulated genes in SF2-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment

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图4 XQ10-1种子变温处理后上调基因Fig.4 The up-regulated genes in XQ10-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment
各基因在变温处理后的相对表达量均以其恒温处理作为对照, 因此各基因的相对表达量均以1作为对照。下同。The expression of the each genes under the variable temperature treatment were compared to the constant temperature control, therefore the expression level of the control groups is 1. The same below.

变温处理1 d后, 在SF2-1和XQ10-1中的表达量都下调的基因有Chi1, CBF3, 5423和SAIN2。在SF2-1中, 有8个基因的表达出现不同程度的下调(图5), SPATULA和Chi1基因下调均在5倍以上。在XQ10-1中, 有6个基因出现不同程度的下调(图6), 且与在SF2-1中的表达相比, Chi1、5423、CBF6、SAIN2在XQ10-1中的表达下调更加明显。

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	图5 SF2-1种子变温处理后下调基因Fig.5 The down-regulated genes in SF2-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment

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	图6 XQ10-1种子变温处理后下调基因Fig.6 The down-regulated genes in XQ10-1 L. chinensis seeds after variable temperature treatment

通过基因表达的分析挑选高萌发率种质SF2-1中表达差异显著的11个基因, 与低萌发率种质XQ10-1中的表达量分别进行比较分析(如图7, 其中下调基因的表达量用负倒数表示)。结果表明, Chi1, CBF3, 5423在两个种质中的表达均下调; 而NAC2, EXPB4, EXPB16和EXPA2在两个种质中的表达均上调。

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	图7 在SF2-1和XQ10-1中均特异表达的基因Fig.7 Genes specifically expressed in both of the seed genotypes SF2-1 and XQ10-1

依据各基因在不同温度处理下萌发的种质中表达的情况, 以相对表达量上调或下调大于2倍为基准, 筛选出9个相关基因, 分别是Chi1、CBF3、5423、NAC2、GA3ox、EXPB4、EXPB16、SAIN1和EXPA2。对上述基因在高萌发率SF2-1种质和低萌发率种质XQ10-1中的表达量进行分析, 若基因在SF2-1中上调倍数大于XQ10-1或在SF2-1种质中下调倍数小于XQ10-1, 则表明该基因与种子萌发相关, 进而明确各基因与变温和萌发的相关程度(表2)。结果表明, 这9个基因在变温条件下均差异表达, 表明这些基因均与变温相关, 而其中6个基因与高萌发率与低萌发率的两个种质均有关。因此, 筛选得到变温影响羊草种子萌发的6个关键基因:Chi1, CBF3, 5423, GA3ox, EXPB4和SAIN1。

表2 与变温或萌发相关的基因 Table 2 The genes related to variable temperature treatment or germination

3 讨论

种子萌发是一个复杂的生理生化过程, 其中相关酶的活性、膜的通透性、膜结合蛋白的活力以及种子内GA和ABA的合成代谢均受温度影响。种子的萌发需要适宜的温度。前人的研究表明, 恒温不利于羊草种子的萌发, 低温和变温都能显著提高种子萌发率。本课题组在对羊草种子萌发的前期研究表明, 恒温(16、20、22、28、37 ℃)处理下羊草中种子萌发率均较低(小于20%), 而在不同的变温(28 ℃ 12 h/16 ℃ 12 h)条件下, 羊草种子萌发率显著升高。在此基础上, 系统地研究了变温对羊草种子萌发的效应, 通过不同时段的变温处理改变种子萌发的温度条件, 发现羊草种子萌发的第1天(第12~24 h)经低温处理可显著提高种子萌发率, 该时段(第12~24 h)可以说是羊草种子萌发中对响应低温信号的关键时段。

细胞壁松弛素家族基因在变温处理后的萌发期羊草种子中表达变化较普遍, 上调较明显。已有研究表明, 在萌发中的拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子中, 相比于在拟南芥中编码细胞松弛蛋白的其他35个基因, EXPA2的表达量极高, 并已证实了EXPA2是种子萌发所必需的, 且EXPA2对萌发的作用受到GA的调控^[29]。前人在番茄(Lycopersicon esculentum)的研究中发现, LeEXP4在胚乳的珠孔端特异表达, 种子萌发过程中mRNA累积水平与胚乳珠孔端的软化程度保持一致, 通过软化胚乳促进胚根的伸出, 进而参与调控种子萌发^{[30, 31]}。本研究中的羊草种子变温处理1 d后, EXPA2表达量上调了13.7倍, EXPB4和EXPB16在变温处理后的表达也有明显的上调, 据此可以初步判断细胞壁松弛素家族基因在羊草种子萌发中有重要作用。

植物激素参与对种子萌发的调控, 其中, GA和ABA的作用较为关键。GA促进种子萌发。已有研究表明, 拟南芥种子经低温处理后, AtGA3ox1及AtGA3ox2的表达量提高, 参与GA的合成代谢^[13]。羊草种子经变温处理后, GA3ox的表达量也明显上调, 可见羊草种子接受变温信号后增强GA的合成, 从而促进萌发。GA2氧化酶参与GA的分解代谢, 我们发现羊草种子在变温处理后其GA2ox的表达也表现为上调, 这可能是种子萌发初期活跃的激素合成与代谢平衡的表现。GA3ox1和GA3ox2的转录受SPATULA抑制, SPATULA通过影响GA代谢而调控萌发, 且受低温层积下调表达^[32]; 发现羊草种子变温处理后, SPATULA的表达下调, 进而可能通过GA效应作用于萌发。ABA维持种子休眠, 抑制萌发。ABA在高等植物中的合成途径中, ZEP可能起关键性作用^[33]; 本实验中经变温处理后的羊草种子, ZEP基因的表达量上调, 可能说明变温萌发中ABA的效应在一定程度上受到抑制。ABI8是ABA信号通路的一个重要调控因子, 在拟南芥中有通过调节细胞纤维素合成影响细胞壁合成的功能^[34], 在本研究中发现, 羊草种子变温处理后, ABI8的表达量有小幅的下调, 可能表明在此过程中ABA含量降低或ABA效应受阻, 降低ABA对种子萌发的抑制效应。

植物中几丁质酶参与植物发育和环境胁迫响应, 目前关于植物几丁质酶基因的研究主要集中在植物的抗病性^[35]。Chi1在羊草种子萌发过程中可能由响应低温信号而表达下调, 其在萌发中具体功能有待进一步研究。转录因子CBF基因包括CBF1、CBF2和CBF3, 在植物冷适应与植物抗冷抗冻性中有重要作用, 已有研究表明CBF突变体表现出对低温冷害的极度敏感^[36]。在羊草种子接受低温信号后, CBF3的表达明显下调, 与植物冷适应过程相反, 在此过程中可能由于CBF3表达的下调提升种子内对低温信号的响应, 从而使低温进入种子萌发相关的信号通路, 促进种子萌发。在羊草种子中, NAC2的表达在低温诱导后的下调明显; 而NAC2在花生(Arachis hypogaea)中参与ABA信号途径, 而且在拟南芥中过量表达NAC2可导致根生长及种子萌发对ABA过度敏感^[37]。SAIN1和5423是在本研究组已有研究中发现的羊草新基因^[38], 在羊草种子变温萌发中的表达分析表明, SAIN1和5423可能与种子萌发有关, 且可能受低温诱导。

本研究在确定羊草种子响应变温的敏感期及关键时间点的基础上, 探究羊草种子萌发过程中变温响应关键时期的基因表达变化, 并初步筛选出可能与羊草种子萌发及变温相关的关键基因, 为深入研究种子萌发、变温响应相关基因的具体功能及种子萌发分子机理奠定了一定的基础。

4 结论

羊草种子萌发中的第一天是接受变温信号的关键时期。本研究对前期羊草种子转录组测序数据深度分析, 筛选与羊草种子萌发、休眠、低温等相关基因24个, 并对这些基因在变温萌发过程中的表达进行分析, 筛选出一些可能与变温处理及种子萌发相关的关键基因。由分析结果得到与变温相关但与萌发无关的基因有转录因子基因NAC2和细胞松弛素编码基因EXPB16、EXPA2; 筛选得到6个与变温处理和萌发均相关的基因, 分别是几丁质酶基因Chi1、低温响应基因CBF3、赤霉素合成相关基因GA3ox、细胞松弛素编码基因EXPB4和羊草新基因SAIN1、5423。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献

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1994

0.0

... 种子的萌发需要适宜的温度条件,有些植物种子的萌发需要变化的温度^[1] ...

2009

0.0

... 种子在开始萌发的过程中,低温信号可导致种子内部激素含量的变化,调控种子萌发^[2] ...

2011

0.0

... 温度的变化也能够影响种子休眠,较高的环境温度中种子休眠度深,而低温对于种子破除休眠有着非常关键的作用^[3] ...

2013

0.0

. 2013, 22(5):183-189 DOI:doi:10.11686/cyxb20130521

Effects of exogenous hormones on the dormancy and germination of Leymus chinensis

羊草种子休眠和萌发的激素调控研究

Huang X H , Hu X W , Xu Z H

黄晓辉, 胡小文, 徐宗海

采用脱落酸（ＡＢＡ）、赤霉素３（ＧＡ３）、赤霉素４＋７（ＧＡ４＋７）３种外源激素和氟啶酮（ｆｌｕｒｉｄｏｎｅ，ＦＬ）、多效唑（ｐａｃｌｏｂｕｔｒａｚｏｌ，ＰＡ）２种激素生物合成抑制剂处理羊草种子，研究其对羊草种子休眠和萌发的影响，结果表明，低浓度外源ＡＢＡ对羊草种子休眠和萌发无影响，高浓度显著抑制其萌发；ＡＢＡ的生物合成抑制剂ＦＬ可逆转ＡＢＡ对萌发的抑制作用，表明吸胀过程中ＡＢＡ的合成是维持羊草种子休眠的重要原因；ＧＡ４＋７显著促进羊草种子萌发，而ＧＡ３没有影响；ＧＡ的生物合成抑制剂ＰＡ可显著降低种子萌发率，但其抑制作用可为外源ＧＡ３所逆转，说明ＧＡ对于非休眠种子的萌发是必须的；ＦＬ＋ＰＡ处理后，尽管吸胀过程中ＡＢＡ的合成受到抑制，但种子的萌发率仍显著降低，进一步支持ＧＡ是种子萌发所必需的结论。除ＦＬ溶液冷层积８周可显著破除羊草种子休眠外，其他介质冷层积均不同程度的诱导种子形成二次休眠，这一过程可能与冷层积中ＡＢＡ含量的增加有关。

... 种子萌发调控中,激素之间的协同和拮抗有重要作用^[4] ...

2005

0.0

... ABA与GA是关键的两种萌发调控激素,其各自的合成与代谢形成的种子内激素含量的平衡决定种子的生理状态,以温度为代表的环境信号通过一系列信号转导途径作用于激素的合成代谢途径,导致激素含量的变化,从而影响种子的萌发^[5] ...

2006

0.0

... GA促进种子萌发的过程中,调控GA合成的关键基因是GA3ox1和GA3ox2^[6],而GA2ox调控GA的降解,GID1是GA信号通路中的关键基因^[7] ...

2008

0.0

... GA促进种子萌发的过程中,调控GA合成的关键基因是GA3ox1和GA3ox2^[6],而GA2ox调控GA的降解,GID1是GA信号通路中的关键基因^[7] ...

2003

0.0

... ABA抑制萌发,拮抗GA的促进作用^[8,9],玉米黄质环氧化酶(zeaxanthin epoxidase,ZEP)和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxy-carotenoid oxygenase,NCED)是ABA合成途径中的两个关键酶,而CYP707A2是ABA降解的关键基因^[10,11],PP2Cs在ABA信号转导中有重要作用^[12] ...

2010

0.0

2005

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2004

0.0

2002

0.0

2004

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... 有研究表明,低温能上调GA合成代谢基因(AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA3ox1)和下调GA分解代谢基因(AtGA2ox2),从而提高种子内活性GA的含量,进而促进萌发^[13] ...

... 已有研究表明,拟南芥种子经低温处理后,AtGA3ox1及AtGA3ox2的表达量提高,参与GA的合成代谢^[13] ...

2013

0.0

... 高温使ABA合成相关基因NCED2,NCED5和NCED9的表达上调,导致ABA水平上升,并抑制GA合成途径基因的表达,使种子萌发受到抑制^[14,15] ...

2008

0.0

... 高温使ABA合成相关基因NCED2,NCED5和NCED9的表达上调,导致ABA水平上升,并抑制GA合成途径基因的表达,使种子萌发受到抑制^[14,15] ...

2000

0.0

... 此外,细胞壁松弛蛋白能够软化胚乳组织,促进细胞壁解聚,帮助胚根伸出^[16] ...

2003

0.0

... 已有研究表明细胞壁松弛蛋白编码基因EXPA1,EXPA2,EXPA3,EXPA8,EXPA9和EXPA20等在吸涨的种子中表达量显著提高,因此细胞壁松弛蛋白在促进种子萌发中有着非常重要的作用^[17,18] ...

2012

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2004

0.0

... 羊草(Leymus chinensis)是我国重要的禾本科牧草^[19],应用价值高,但种子萌发率偏低限制了羊草种子的生产应用^[20] ...

1986

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. 1986, (5):54-56, 80

Study on germination rate of sheepgrass seeds

羊草种子发芽率的研究

Zhao C X , Yang Y F , Zhang G T

赵传孝, 杨根凤, 张国瞳

正羊草(Aneurolepidium chinensis)以无性繁殖为主,种子结实率低,天然羊草地亩产种子约8—10斤。据我们测定,1克羊草种子450—500粒,其中具胚和胚乳的饱满种子250—280粒,但是田间发芽率仅10—20％。因此生产上迫切需要提高羊草的发芽率,以减少单位面积的播种量,降低生产成本,使苗全、苗壮,增加饲草产量。

... 羊草(Leymus chinensis)是我国重要的禾本科牧草^[19],应用价值高,但种子萌发率偏低限制了羊草种子的生产应用^[20] ...

2005

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. 2005, 27(2):50-54

Effects of low-temperatures on seed germination of Leymus chinensis and Pascopyrum smithii

低温对羊草和冰草种子萌发率的影响

Gu A L , Yi J , Roman H

谷安琳, 易津

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2005

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. 2005, (4):64-68 DOI:doi:10.3321/j.issn:1673-5021.2005.04.012

Research progress on improving germination rate of Leymus chinensis

提高羊草种子发芽率方法研究进展

Ma H Y , Liang Z W , Chen Y

马红媛, 梁正伟, 陈渊

摘　要：总结了近年来国内外羊草种子休眠机理和提高发芽率方法的最新研究成果.提高羊草种子发芽率的方法可以概括为物理方法、化学方法和激素方法,其中变温与低温处理是目前提高羊草种子发芽率的有效途径与方法,具有生产实践意义,值得今后深入研究.为此,探讨了有关方面存在的主要问题,并对今后的研究方向提出了具体建议.

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2008

0.0

. 2008, 28(10):4710-4717 DOI:doi:10.3321/j.issn:1000-0933.2008.10.011

Effects of salinity, temperature and their interaction on the germination percentage and seedling growth of Leymus chinensis

盐分、温度及其互作对羊草种子发芽率和幼苗生长的影响

Ma H Y , Liang Z W , Kong X J

马红媛, 梁正伟, 孔祥军

Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. (Poaceae) is a perennial, high quality grass and is the dominant species in Songnen plain, China. Seed germination and seedling growth of Leymus chinensis were investigated under eight levels of salinity stress (0, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 mmol/L NaCl) and three temperature regimes (16/28℃, 5/28℃, and 5/35℃) and then after the salinity stress was removed. The results of a two-way ANOVA showed that salinity (including when the salinity stress was removed), temperature and their interaction significantly affected the seed germination and seedling growth of L. chinensis. The highest germination percentage was obtained under non-saline conditions, and with an increase of NaCl concentration, germination significantly decreased. Seed germination at the moderate temperature regime of 5/28℃ was optimal, with 25.3% of seeds germinating in 200 mmol/L NaCl. The salinity inhibition for seed germination was greatest at 5/35℃ when no seeds germinated above a concentration of 100 mmol/L NaCl while the salinity inhibition was lightest at 5/28℃. After 18 days, seeds were transferred from salt solutions to distilled water and those from high salinities (≥150 mmol/L), the seed germination recovered most quickly at 5/28℃, and slowest at 5/35℃. At 16/28℃, germination percentage increased with the pre-treatment NaCl concentration. At 5/28℃, germination increased between 0 to 150 mmol/L and then changed little when NaCl was more than 150 mmol/L. However, seed germination percentage increased from 0 to 100 mmol/L and then decreased from 100 to 500 mmol/L. Seedling growth was also significantly inhibited by salinities. Under NaCl stress, seedlings grew best at 16/28℃, moderately well at 5/28℃ and seedling growth was significantly inhibited at 5/35℃. Seedlings which germinated after being transferred to distilled water showed different growth patterns with different pre-treatment salinity and temperature regimes. At 16/28℃ and 5/28℃, root and shoot length increased with a pre-treatment NaCl concentration of 0-100 mmol/L but changed little when it was more than 100 mmol/L. At 5/35℃, the maximum values of shoot and root length occurred at 100 mmol/L NaCl, and then decreased when the concentration was over 100 mmol/L.

羊草是多年生优质牧草，也是中国松嫩平原的优势建群植物。研究了羊草种子在8种浓度(0、50、100、150、200、300、400和500 mmol/L) NaCl胁迫及将胁迫解除后在3种变温(16/28℃、5/28℃和5/35℃)条件下的发芽率以及幼苗的生长变化。双因素方差分析表明，NaCl胁迫解除前后盐浓度、温度及其互作均极显著影响羊草种子萌发和幼苗生长。胁迫解除前，在3种温度下，羊草种子发芽率最高出现在没有盐胁迫的条件下，随着NaCl浓度的增加，发芽率呈下降趋势。5/28℃下，NaCl溶液对种子萌发抑制最小，浓度达到200 mmol/L时，仍有25.3%的种子萌发；在5/35℃下，对种子萌发抑制作用最大，浓度超过100 mmol/L时，种子萌发被完全抑制；16/28℃的处理介于二者之间。胁迫解除后，羊草种子在3种温度下发芽趋势不同。16/28℃下表现为NaCl浓度较大的处理发芽率较高，5/28℃下则呈先上升(0~150 mmol/L)后基本保持不变趋势；5/35℃下则呈先上升后下降趋势。盐胁迫下，羊草幼苗在16/28℃变温下生长最好，其次为5/28℃，5/35℃生长最差。盐胁迫解除后，16/28℃和5/28℃下，0~100 mmol/L NaCl处理的幼苗根长和苗长随浓度增加而显著上升，大于此浓度变化较小；在5/35℃下，100 mmol/L NaCl处理的幼苗根长和苗长最大，而浓度大于100mmol/L时,则随着NaCl浓度增加呈下降趋势。

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2011

0.0

. 2011, (6):1005-1009 DOI:doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2011.06.020

Effect of temperature, salinity, alkalinity and their interactions on seed germination and seedling growth of Leymus chinensis

温度与盐碱胁迫交互作用对羊草种子萌发与幼苗生长的影响

Lin J X , Li X Y , Zhang Z J

蔺吉祥, 李晓宇, 张兆军

Leymus chinensis is the dominant species in Songnen salt-alkali grassland of Northern China.The effects of temperature(20/10℃,30/20℃ and 35/25℃),salinity(NaCl:Na 2 SO 4 = 9:1),alkalinity(NaHCO 3 :Na 2 CO 3 = 9:1) and their interactions on seed germination and seedling growth of Leymus chinensis were investigated.Results showed that seed germination rate,root length and leaf length all decreased with added salinity and alkalinity stress compared with other treatments.Seed germination and seedling growth were inhibited under stress of extreme temperature and salinity interactions or extreme temperature and alkalinity interactions.Low temperature inhibited seed germination with salinity -1 .Effects were aggravated by extreme high temperature with increased salinity.Under alkali stress,germination percentage and germination rate both decreased markedly by high temperature(35/25℃) even though the alkalinity was very low.Results indicate that seed germination and seedling growth of Leymus chinensis are affected by temperature,salinity,alkalinity and their interactions.The deleterious effect of alkali stress on seed germination and seedling growth of Leymus chinensis is more severe than salt stress.

羊草( Leymus chinensis )是我国东北松嫩盐碱化草地上的建群植物。为明确羊草在种子萌发与幼苗生长阶段对盐、碱胁迫及与温度交互作用的响应,采用3个温度处理(20/10℃,30/20℃和35/25℃),并混合2种中性盐(NaCl:Na 2 SO 4 =9:1)与2种碱性盐(Na 2 CO 3 :NaHCO 3 =9:1)分别模拟土壤盐、碱胁迫条件进行研究。结果表明:随着盐碱胁迫浓度的增加,羊草种子的发芽率、发芽速率、叶片长度与根系长度均呈下降趋势,且在碱胁迫下其降幅更大;另外这2种胁迫均对羊草幼苗根生长的抑制作用更强。温盐、温碱交互作用显著影响羊草种子的萌发与幼苗生长,其中30/20℃处理下羊草生长最好;在盐胁迫下,当盐浓度 -1 时,低温是影响种子萌发的主要因素,随着盐度继续增加,高温则加剧了盐胁迫对种子萌发的抑制作用;在碱胁迫下,即使碱浓度较低,高温与其交互作用也极大地加剧了对种子发芽的抑制。因此,盐、碱胁迫及温盐、温碱交互作用对羊草种子萌发与幼苗生长的抑制作用明显不同,碱胁迫及其与温度交互作用对羊草的伤害更大。

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2014

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. 2014, 36(3):47-51 DOI:doi:10.3969/j.issn.1673-5021.2014.03.009

Comparisons of several methods of improving seed germination percentage of Leymus chinensis

几种提高羊草种子发芽率方法的比较

Lin J X , Shao S , Sui D

蔺吉祥, 邵帅, 隋丹

对几种可以有效提高羊草种子发芽率的方法进行了归纳,并综合分析了不同处理下各发芽参数的变化。结果表明:除热水浸种(60℃和80℃)不利于羊草种子萌发外,其余方法如浓硫酸处理(50%、70%和98%)、冷层积处理(10d、15d和20d)、PEG处理(2%和5%)、硝酸钾溶液处理(2%和4%)以及清水(24h和48h)浸种等方法都能在一定程度上破除种子休眠,提高发芽率。实际生产中推荐低温浸种20d的方法,可有效提高羊草种子发芽率。

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2010

0.0

. 2010, 30(1):120-125

Study on seed dormancy mechanism and breaking technique of Leymus chinensis

羊草种子休眠机制及破除方法研究

He X Q , Hu X W , Wang Y R

何学青, 胡小文, 王彦荣

羊草种子休眠程度深、发芽率低是限制栽培利用的重要因子.采用不同破除羊草种子休眠的方法,测定各处理对种子萌发的影响,以探索破除羊草种子休眠的有效途径.结果显示:(1)刺破种皮的裸种子较完整种子的萌发率、吸水速率、生活力分别由对照的6%、63%、0%显著增加到60%、86%、94%.(2)完整羊草种子分别用清水浸种1 d、30% NaOH浸种80 min、清水浸种1 d后用30% NaOH浸种60min其萌发率由6%分别显著提高到36%、60%、84%,而各浓度赤霉素处理完整种子其萌发率较对照均无显著变化. (3)采用清水浸种1 d后用30% NaOH处理60 min,再施加200 μg/g GA3综合处理,可使羊草完整种子的发芽率由6%提高到91%,接近其种子生活力94%.研究表明,羊草种子的稃与种皮不影响种子水分的吸收,但影响种子对GA3的吸收、不同程度地阻碍大分子物质的渗入、限制羊草种子内部萌发抑制物的渗出,从而引起种子休眠;分析认为稃和种皮以及种子内部萌发抑制物质是引起羊草种子休眠的主要原因. Abstract： Seed dormancy of Leymus chinensis is one of the most important factors limiting its culture and utilization.Present study investigated the seed dormancy mechanism and dormancy breaking technique of L.chinensis and the results showed that:(1) Piercing naked seed compared with intact seed the germination rate,water absorption rate,viability by contrast,6%,63%,0% significantly increased to 60%,86%,94%;(2)Water soaking one day,30% NaOH soaking 80 min,soaking in 30% NaOH for 60 min after soaking with water for one day could complete germination rate of L.chinensis intact seeds significantly from 6% to 36%,60%,84%,while the different concentration of gibberellin treatment to intact seeds had no significant changes compared with the control;(3) Seeds soaked with 30% NaOH by 60 min after soaked with water one day,and then imposed 200 μg/g GA3,could germinate to 91%,close to the seed viability 94%.This study showed that glume and seed coat did not affect the seed imbibition rate,but affected absorption of GA3 and water absorption had been hampered to varying degrees by macromolecular substances,which led to seed dormancy.These results implied that palea,seed coat,and germination inhibitors contained in the seeds may play an important role in controlling seed dormancy of L.chinensis.

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2012

0.0

... 已有研究表明变温能够促进羊草种子萌发,而恒温不利于其萌发^{[21,22,23,24,25,26,27]} ...

2001

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... Ct方法对所得数据进行相对定量分析^[28] ...

2014

0.0

... 已有研究表明,在萌发中的拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子中,相比于在拟南芥中编码细胞松弛蛋白的其他35个基因,EXPA2的表达量极高,并已证实了EXPA2是种子萌发所必需的,且EXPA2对萌发的作用受到GA的调控^[29] ...

2000

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... 前人在番茄(Lycopersicon esculentum)的研究中发现,LeEXP4在胚乳的珠孔端特异表达,种子萌发过程中mRNA累积水平与胚乳珠孔端的软化程度保持一致,通过软化胚乳促进胚根的伸出,进而参与调控种子萌发^[30,31] ...

2000

0.0

2005

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... GA3ox1和GA3ox2的转录受SPATULA抑制,SPATULA通过影响GA代谢而调控萌发,且受低温层积下调表达^[32] ...

2013

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... ABA在高等植物中的合成途径中,ZEP可能起关键性作用^[33] ...

2015

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... ABI8是ABA信号通路的一个重要调控因子,在拟南芥中有通过调节细胞纤维素合成影响细胞壁合成的功能^[34],在本研究中发现,羊草种子变温处理后,ABI8的表达量有小幅的下调,可能表明在此过程中ABA含量降低或ABA效应受阻,降低ABA对种子萌发的抑制效应 ...

2013

0.0

... 植物中几丁质酶参与植物发育和环境胁迫响应,目前关于植物几丁质酶基因的研究主要集中在植物的抗病性^[35] ...

2016

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... 转录因子CBF基因包括CBF1、CBF2和CBF3,在植物冷适应与植物抗冷抗冻性中有重要作用,已有研究表明CBF突变体表现出对低温冷害的极度敏感^[36] ...

2011

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... 而NAC2在花生(Arachis hypogaea)中参与ABA信号途径,而且在拟南芥中过量表达NAC2可导致根生长及种子萌发对ABA过度敏感^[37] ...

2013

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... SAIN1和5423是在本研究组已有研究中发现的羊草新基因^[38],在羊草种子变温萌发中的表达分析表明,SAIN1和5423可能与种子萌发有关,且可能受低温诱导 ...