本实验所用材料紫花苜蓿为黑龙江省农业科学院草业研究所培育的紫花苜蓿品种“ 农菁1号” 。

实验于2013年1月到2016年12月在东北林业大学盐碱地资源与环境中心进行, 采用Trizol法提取苜蓿总RNA, 使用RT-PCR试剂盒(Takara生物公司)进行反转录获得苜蓿cDNA, 以cDNA为模板, 根据NCBI中紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(AF189766.1)序列设计的一对特异性引物:MsMT1F和MsMT1R(表1)为引物, 进行PCR扩增, PCR反应条件为:94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 30个循环; 72 ℃补充延伸10 min。扩增产物电泳检测后用胶回收试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)进行胶回收, 将回收片段连接到PMD-18T载体(Takara公司)并转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上, 37 ℃过夜培养, 挑取单克隆摇菌, PCR鉴定阳性单克隆的菌液送公司测序。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实验中所用到的引物序列 Table 1 Sequence of primers used in the experiment 引物名称Primers 引物序列Sequences MsMT1F 5'-ATGTCTGGCTGTAATTGTGG-3' MsMT1R 5'-TCATTTGCAGTTGCAAGGGT-3' 18SrRNAF 5'-GAGAAACGGCTACCACATCCA-3' 18SrRNAR 5'-CCCAACCCAAGGTCCAACTAC-3'

表1 实验中所用到的引物序列 Table 1 Sequence of primers used in the experiment

将测序结果输入DNA Man软件查询该基因的ORF区, 然后将克隆基因的碱基序列输入NCBI中进行blast分析并寻找出相似度较高的其他物种金属硫蛋白的氨基酸序列, 利用DNA Man软件进行蛋白质同源氨基酸序列对比, 最后通过MEGA3.1构建进化树, 观察苜蓿金属硫蛋白基因与其他金属硫蛋白的亲缘关系的远近。

分别提取新鲜紫花苜蓿根、茎、叶、种子、子叶的RNA, 反转录成cDNA。根据MsMT1基因和18S rRNA序列(KJ507198)设计两对引物(表1)。利用UltraSYBR Mixture试剂(北京康为世纪生物科技有限公司)进行实时荧光定量qRT-PCR检测, 每个样品做3个平行实验。 PCR反应体系为20 μ L(2× SYBR Green mix 10 μ L; 10 μ mol· L^-1上下游引物各0.5 μ L, cDNA模板1.0 μ L; ddH₂O 8.0 μ L); 反应条件为:95 ℃预变性10 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 40个循环。得到苜蓿各器官中MsMT1基因的表达量, 利用SPSS软件进行方差分析。

将苜蓿种子消毒后置于含有MS培养基的平板中培养。一周后, 将长出子叶和根的苜蓿幼苗转移到未加入任何胁迫处理的MS培养基(CK)和含有NaCl(150、200、250 mmol· L^-1)、Na₂CO₃(50、75、100 mmol· L^-1)、NaHCO₃(50、75、100 mmol· L^-1)、酸碱度(pH值7、8、9、10)的MS培养基上培养24 h后, 分别提取根和子叶的RNA。将RNA反转录为cDNA, 利用qRT-PCR分析MsMT1基因在逆境处理后的苜蓿根和子叶中的表达情况, 最后利用SPSS进行方差分析。

苜蓿MsMT1基因构建到植物表达载体PBI121后, 转化到农杆菌菌株EH105中, 利用农杆菌介导法将苜蓿MsMT1基因转入紫花苜蓿本体中, 将过表达MsMT1的紫花苜蓿种子和野生型紫花苜蓿的种子播种在MS培养基上, 培养两周后提取植物总RNA, 以MsMT1基因全长做成杂交探针, 通过Northern杂交方法^[17]进行MsMT1基因过表达紫花苜蓿植株的分子检测。将检测后的MsMT1过表达株系与种子野生型的紫花苜蓿种子分别放置滤纸上发芽, 一周后选取长势一致的MsMT1过表达株系与野生型的紫花苜蓿幼苗分别移栽到底部打孔的含有草炭土∶ 蛭石=3∶ 1的塑料营养钵中, 各分7组, 每钵种5株苗, 设3个重复。分别用水(CK)、NaCl(200、300、400 mmol· L^-1)、NaHCO₃(50、100、200 mmol· L^-1)进行胁迫处理, 每盆苗浇40 mL处理液, 每2 d补加40 mL处理液, 15 d后观察表型, 每个处理重复3次。

以紫花苜蓿cDNA为模板, 以MsMT1F, MsMT1R为引物, 进行PCR扩增, PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示成功获得一条约为200 bp大小的DNA条带(图1)。将条带回收纯化, 连接到PMD-18T载体(Takara公司), 转化到大肠杆菌DH5α 中, 挑取单克隆进行PCR检测, 将检测的阳性单克隆送公司测序。

图1

Fig.1

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	图1 紫花苜蓿MsMT1基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of MsMT1 from M. sativa M: DL2000 marker; 1: MsMT1.

将基因的碱基序列输入NCBI中进行Blast分析, 发现该基因与紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(AF189766.1)相似度达到了99%。利用DNA Man软件翻译的氨基酸序列, 在NCBI中找到与克隆出的基因氨基酸序列相似度高的其他物种的1型金属硫蛋白, 利用DNA Man软件将从紫花苜蓿中克隆出的基因的氨基酸序列与其他物种的1型金属硫蛋白(MsMET1:紫花苜蓿 Medicago sativa MT1 AAF04584.1; CaMT1: 鹰嘴豆Cicer arietinum MT1 XP004506573.1; PsMT1:菜豌豆Pisum sativum MT1 BAD18382.1; VfMT1:蚕豆Vicia faba MT1 BAD18380.1; GmMT1:大豆Glycine max MT1 XP003550282.1; VrMT1:绿豆Vigna radiata MT1 BAD18374.1; VaMT1:红豆Vigna angularis MT1 BAD18378.1; LpMT1:扁豆Lablab purpureus MT1 BAD18384.1; CcMT1:木豆Cajanus cajan MT1 XP020202997.1; GaMT1:木本棉Gossypium arboreum XP017643720.1; MnMT1:川桑Morus notabilis MT1 XP010106473.1)的氨基酸序列进行比对, 发现该蛋白的氨基酸序列与其他植物的1型金属硫蛋白具有较高的同源性以及相似的保守区, 所以可以断定实验中克隆出的基因为苜蓿1型金属硫蛋白(图2), 将该基因命名为MsMT1。

图2

Fig.2

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	图2 MsMT1与其他植物同源蛋白的氨基酸序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of MT1 from different species

利用MEGA3.1构建进化树, 根据进化关系发现MsMT1蛋白与紫花苜蓿、菜豌豆、蚕豆、大豆等豆科植物的MT1亲缘关系较近, 与木本棉的MT1亲缘关系较远(图3)。

图3

Fig.3

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	图3 MsMT1与同源蛋白的进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analyses of MsMT1 and orthologs

运用高灵敏度的qRT-PCR检测MsMT1基因在苜蓿不同器官的表达特异性, 发现3组重复的表达量差异不大, 说明数据具有可靠性。本研究中MsMT1基因在苜蓿的根和子叶中表达量较高, 其次是种子、叶, 在苜蓿茎中表达量较低(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 苜蓿不同器官MsMT1 基因表达的定量比较不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.4 Quantitive comparison of MsMT1 gene expression in M. sativa Different letters mean significant differences (P< 0.05). The same below.

不同浓度NaCl处理24 h下苜蓿根和子叶中MsMT1基因表达的定量比较, 苜蓿根中的MsMT1基因表达量随NaCl浓度增加而增加(图5)。苜蓿子叶中MsMT1基因表达量在0~150 mmol· L^-1时随NaCl浓度增加而增加, NaCl浓度为200 mmol· L^-1表达量降低(图5)。

图5

Fig.5

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	图5 在不同浓度NaCl处理的苜蓿根和子叶中MsMT1基因的相对表达量Fig.5 Quantitative comparison of MsMT1 gene expression in roots and cotyledons of M. sativa under NaCl stress

不同浓度NaHCO₃处理24 h下苜蓿根和子叶中MsMT1基因表达的定量比较, 苜蓿根中的MsMT1基因表达量随NaHCO₃浓度增加而增加(图6)。苜蓿子叶中MsMT1基因表达量先降低后升高(图6)。

图6

Fig.6

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	图6 在不同浓度NaHCO3处理苜蓿根和子叶中MsMT1基因的相对表达量Fig.6 Quantitative comparison of MsMT1 gene expression in roots and cotyledons of M. sativa under NaHCO3 stress

不同浓度Na₂CO₃处理24 h下苜蓿根和子叶中MsMT1基因表达的定量比较, 苜蓿根和子叶中的MsMT1基因表达量在50 mmol· L^-1 Na₂CO₃处理时表达量提高, 之后逐渐下降(图7)。

图7

Fig.7

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	图7 不同浓度Na2CO3处理苜蓿根和子叶MsMT1基因的相对表达量Fig.7 Quantitative comparison of MsMT1 gene expression in roots and cotyledons of M. sativa under Na2CO3 stress

不同pH值处理24 h下苜蓿根和子叶中MsMT1基因表达的定量比较, 苜蓿根中的MsMT1基因表达量在pH 7到pH 9时缓慢上升, 趋势不明显, 在pH 10时上升明显(图8)。苜蓿子叶中的MsMT1基因表达量先上升, 然后下降, 趋势不明显, pH 9和pH 10时表达量明显上升(图8)。

图8

Fig.8

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	图8 不同pH处理苜蓿根和子叶MsMT1基因的相对表达量Fig.8 Quantitative comparison of MsMT1 gene expression in roots and cotyledons of M. sativa under pH value stress

通过以上研究发现, 不同浓度盐碱处理下, MsMT1基因的相对表达量发生变化, MsMT1基因不同程度上受盐碱胁迫的诱导, 推测MsMT1基因对盐碱胁迫能产生应激反应。

将过表达MsMT1的紫花苜蓿种子和野生型紫花苜蓿的种子播种在1/2MS培养基上, 培养两周后提取总RNA, 按照Northern杂交方法, 利用地高辛标记MsMT1基因的特异性探针进行Northern杂交(图9), 均检测到一条明显的杂交信号, 与野生型紫花苜蓿植株杂交信号相比, #1、#2、#3、#4的杂交信号比野生型强, 说明#1、#2、#3、#4为MsMT1基因过表达株系, 其中#2株系信号最强。

图9

The detection of MsMT1 transgenic M. sativa by Northern blot WT: 非转基因植株 Wild type plant ; #1~#5: 转基因植株Transgenic plants.

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	图9 转MsMT1 基因紫花苜蓿的Northern杂交检测Fig.9

用#2转基因株系作为实验材料, 野生型为对照。分别用水(CK)、NaCl(200、300、400 mmol· L^-1)、NaHCO₃(50、100、200 mmol· L^-1)进行胁迫处理。15 d后观察到CK组野生型与#2株系无明显差异(图10); 在200 mmol· L^-1 NaCl处理下, 野生型与#2株系生长均受到抑制; 在300 mmol· L^-1 NaCl处理下, 野生型与#2株系叶片均开始变黄, 野生型开始出现枯萎; 在400 mmol· L^-1 NaCl处理下, 野生型全部枯萎死亡, #2株系有部分存活植株; 在50 mmol· L^-1 NaHCO₃处理下, 野生型叶片开始变黄, 部分枯萎, #2株系受胁迫不明显; 在100 mmol· L^-1 NaHCO₃处理下, 野生型受胁迫严重, 仅一株存活, #2株系生长也受到抑制; 在200 mmol· L^-1 NaHCO₃处理下, 野生型全部枯萎, #2株系部分存活。由胁迫后的表型可以看出过表达MsMT1基因能够提高紫花苜蓿对盐碱的抗性。

图10

Fig.10

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	图10 转MsMT1基因紫花苜蓿盐胁迫表型分析Fig.10 Phenotype analysis of MsMT1 transgenic M. sativa under salt stress