引黄灌区不同种植年限紫花苜蓿土壤养分与细菌群落特征研究
张文文, 刘秉儒*, 牛宋芳
宁夏大学西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地, 宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室, 宁夏 银川 750021
*通信作者. E-mail: bingru.liu@163.com

作者简介:张文文(1994-),女,甘肃陇南人,在读硕士。E-mail: 1098880134@qq.com

摘要

以宁夏引黄灌区种植年限为16年(2012-2017年)的紫花苜蓿地土壤为研究对象,采用16S rRNA扩增子测序技术对细菌群落组成、丰度和多样性等特征进行研究,分析了土壤养分与细菌种群多样性的相关关系。结果表明:不同种植年限苜蓿地土壤中共检测出细菌约40个门、78个纲、151个目、275个科和416个属;在门水平下细菌的优势门类为变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门,共占细菌总数的68%;随种植年限的增加,细菌菌群丰度和多样性变化表现为1 yr>5 yr>3 yr>4 yr>2 yr>6 yr;土壤pH、有机碳、全氮和碱解氮呈先降低后增大的变化趋势,且都在第5年时达到最大,与细菌群落组成变化规律基本保持一致。Spearman相关性分析结果表明,有机碳、全氮和碱解氮对细菌群落组成具有显著影响( P<0.05)。

关键词: 紫花苜蓿; 细菌群落; 细菌丰度; 多样性; 土壤养分
Correlation between soil nutrient status and the bacterial community composition in alfalfa stands of different ages in the Yellow River irrigation area
ZHANG Wen-wen, LIU Bing-ru*, NIU Song-fang
Breeding Base of State Key Laboratory for Preventing Land Degradation and Ecological Restoration, Key Laboratory for Restoration and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Northwest China of Ministry of Education, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
*Corresponding author. E-mail: bingru.liu@163.com
Abstract

The soil bacterial community composition, abundance and diversity were studied in alfalfa stands between 1-6 years of age (i.e. established 2012-2017), in the Ningxia Yellow River irrigation area. The determination of the soil bacterial community characteristics was achieved by DNA extraction followed by PCR amplification, and sequencing using the HiSeq platform. The 16S rRNA amplifier sequencing technique was used in the study. The correlation between soil nutrients and bacterial population diversity was analyzed. The results indicate that there are about 40 phyla, 78 classes, 151 orders, 275 families and 416 genera of bacteria in the soils of the various alfalfa stands of different ages. At the phylum level, the dominant genera of bacteria detected were Proteobacteria, Acidobacteria and Bacteroidetes, accounting for 68% of the total bacterial population. The ranking of bacterial abundance and diversity with stand age was: 1 yr>5 yr>3 yr>4 yr>2 yr>6 yr. Soil pH, organic carbon, total nitrogen and alkali-hydrolysable nitrogen all decreased initially, and then increased with stand age, reaching their maxima at year 5. The result is basically consistent with findings of other studies of factors affecting bacterial community composition. Analysis using Spearman’s correlation showed that organic carbon, total nitrogen and alkaline nitrogen were significantly ( P<0.05) correlated with bacterial community composition. In general, the dominant taxa of soil bacterial communities present in the Yellow River irrigation area did not change with stand age, but population numbers and bacterial community diversity did vary from year to year, though not with any consistent trend over time. Soil organic carbon, soil alkali-hydrolysable nitrogen and soil total nitrogen were the main factors associated with changes in bacterial taxa present across years.

Keyword: alfalfa; bacterial community; bacterial abundance; diversity; soil nutrients

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 直接或间接参与土壤碳氮养分循环、土壤结构的优化、植物生长调节等过程[1, 2, 3, 4], 土壤细菌作为土壤微生物的主要成员, 能够快速高效地分解与转化营养物质[5], 影响植物对养分的获取和土壤肥力[6], 同时细菌群落结构的差异和变化规律也能反映土壤现状及变化趋势, 可用来指示土壤生态功能, 因此土壤细菌群落和土壤养分关系的研究对引黄灌区紫花苜蓿(Medicago sativa)的生长具有重要指导意义。高通量测序技术能够全面系统的分析土壤细菌的多样性, 深度测序的性能是高通量测序技术的优点所在[7], 也为本领域研究提供了极大的技术便利。

宁夏引黄灌区享引黄灌溉之利, 水土光热资源充足, 农业发达, 灌溉历史悠久, 是全国12个商品粮基地之一[8, 9]。因日照充足, 有灌溉条件, 宁夏成为全国最适合种植苜蓿的区域, 截止2015年, 紫花苜蓿种植面积已达40多万hm2, 干草产量达1822 t· hm-2, 为宁夏畜牧业带来极大经济效益[10]。以往关于紫花苜蓿的研究主要集中在土壤养分变化, 如杨恒山等[11, 12]通过对不同种植年限紫花苜蓿土壤养分变化研究得到种植苜蓿对土壤理化性状具有显著影响, 除pH外不同种植年限间差异明显, 任继周[13]研究表明土壤有机质和全氮含量随着种植年限的增加而升高, 但其增长率随种植年限的增加而降低。也有学者提出苜蓿地土壤养分增长年限受区域影响, 如黄土高原区土壤有机质、全氮的变化表现为种植 510 年为增长期[14], 干旱区表现为种植4年养分含量最高[15]。引黄灌区苜蓿种植最佳年限的探讨尚有缺乏, 且大多学者研究主要集中于土壤养分和团粒结构, 在土壤微生物与土壤养分之间的互作关系等方面研究尚不清楚。鉴于此, 本研究采用16S rRNA扩增子测序技术研究了宁夏引黄灌区不同种植年限(16年)紫花苜蓿土壤细菌群落和土壤养分分布特征, 旨在从微生物和养分等角度探讨紫花苜蓿的最佳种植年限, 为西北地区紫花苜蓿种植及持续高产提供科学指导。

1 材料与方法
1.1 研究区概况及样品采集

研究区位于宁夏回族自治区银川市(N 38° 30', E 106° 06')西夏区贺兰山人工紫花苜蓿农场。研究区海拔为1135 m, 属于温带大陆性季风气候, 年平均气温为8.4 ℃, 最高气温为38 ℃, 最低气温为-20 ℃, 年平均降水量约为200 mm, 年蒸发量约为2250 mm, 年平均日照时数为3075.5 h, 无霜期为160 d, 土壤类型为淡灰钙土, 地下水位约45 m[16]

本研究分别以种植时间为16年(2012-2017年)的紫花苜蓿地为6个处理, 每个处理设置3个面积30 m× 30 m的小样方作为3个重复, 每个小样方按照S型布点, 清除掉地上凋落物和其他多余物质, 用直径4 cm、高20 cm土钻, 采用5点混合法取020 cm土壤样品, 每个重复均取3个平行样, 6个处理共采集土样54个。每个土样采集2份, 1份将鲜样装入经高温灭菌的冻存管并立即放入-196 ℃的液氮带回室内测定, 另1份装入自封袋带回实验室自然风干, 并按照实验后期要求过筛用于土壤各项理化指标测定。

1.2 测定方法

土壤理化指标测定:采用水土比2.5:1.0悬液测定土壤pH; 采用水土比5:1浸提液测定土壤电导率; 采用重铬酸钾氧化-外加热法测定土壤有机碳; 采用凯式定氮法测定全氮; 采用碱解扩散法测定碱解氮; 采用NaOH碱溶-钼锑抗比色法测定全磷; 采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定速效磷[17]

细菌总DNA的提取:土壤碾碎过0.18 mm筛后, 首先采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium ammonium bromide)或十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl sulfate)方法对样本的基因组DNA进行提取, 用Qubit 2.0检测DNA浓度, 琼脂糖凝胶检测DNA完整性[18]。每个样品3个重复, 将同一样品的土壤DNA混合, 作为每份土壤样品的总DNA。取适量的样品于离心管中, 使用无菌水稀释样品至1 ng· μ L-1, 以稀释后的基因组DNA为模板, 采用16S rRNA基因中的V4高变区引物515 F和806 R鉴定细菌多样性, New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR扩增, 确保扩增效率和准确性, 根据PCR产物浓度进行等量混样, 充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 之后通过HiSeq 2500 PE 250进行上机测序。下机数据采用prinseq去除低质量的数据(reads), 然后根据下机得到的数据之间的overlap关系将成对的reads拼接成一条序列, 为得到高质量的reads, 去除tags两端的barcode引物序列, 去除嵌合体及其短序列等后得到clean tags[19, 20]。拼接过滤后的clean tags与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列, 并最终去除其中的嵌合体序列[21], 得到最终的有效序列(effective tags)。

1.3 数据分析

利用Uparse软件对序列进行聚类, 相似性定为0.97, 操作分类单元被认为可能接近于属。用Qiime软件(Version 1.9.1)中的blast方法与Unit数据库进行物种分类、细菌丰度及多样性指数的计算、环境因子(土壤理化数据)关联分析和主成分分析(principle component analysis, PCA), 使用R软件(Version 2.15.3)绘制PCA和环境因子分析热图。采用SPSS 19.0对土壤理化数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析
2.1 不同种植年限苜蓿地土壤养分变化

表1可知, 研究区pH为 8.58.7, 属于碱性土壤。多重比较结果显示, 随着种植年限的增加, 土壤电导率、全磷和速效磷含量均无显著变化; 土壤、有机碳、全氮和碱解氮含量均表现为先降低后增高的趋势, 且在第5年达到最大, 说明苜蓿地土壤养分随着种植年限的增加可能会出现一个周期性的变化规律。

表1 不同种植年限紫花苜蓿土壤理化性状 Table 1 Soil physical and chemical properties of alfalfa with different cultivation years (mean± SD, n=3)
2.2 不同种植年限苜蓿地土壤OTU水平分析

对操作分类单位(operational taxonomic units, OTU)聚类和注释结果显示, 6个样本得到的总tag数为518456, 其中用于构建OTUs并且获得注释信息的tags数为483980, 占总数的95%; unclassified tags和频数为1的unique tags是无法被聚类到OTUs的tags数目, 共计24477, 各样本统计结果如表2所示。采用随机抽样方法抽取数据, 随机抽取它们所代表物种数目(即OTUs数目), 以抽取的测序数据量与对应的物种数来构建稀释曲线。6个样本的稀释曲线如图1所示, 不同种植年限苜蓿地土壤细菌丰富程度表现为1 yr> 5 yr> 4 yr> 3 yr> 6 yr> 2 yr。

表2 不同种植年限苜蓿地土壤OTU聚类和注释情况统计 Table 2 Statistics of soil OTU clustering and annotation in alfalfa fields with different cultivation years

图1 细菌稀释曲线分析Fig.1 Analysis of bacterial dilution curve

2.3 不同种植年限苜蓿地土壤细菌组成分析

2.3.1 各样地细菌群落在门水平上的组成和相对丰度 6个不同种植年限苜蓿地土壤样品中细菌群落相对丰度前十的细菌门分别为:变形菌门(Proteobacteria) (44%)、酸杆菌门(Acidobacteria) (13%)、拟杆菌门(Bacteroidetes) (11%)、厚壁菌门 (Firmicutes) (4%)、放线菌门(Actinobacteria) (5%)、单胞菌门(Gemmatimonadetes) (6%)、疣微菌门(Verrucomicrobia) (3%)、浮霉菌门(Planctomycetes) (3%)、绿弯菌门(Chloroflexi) (2%)和奇古菌门(Thaumarchaeota) (0.2%), 共占细菌总数的91.2%。其中变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门占细菌总数的68%, 说明这3个门的细菌为苜蓿地土壤样本中较具优势的菌群。除厚壁菌门在6年中有大幅度的波动变化外(相差10倍左右), 其余菌门变化幅度都较小, 16年总体变化呈先升高后降低的变化趋势, 这与之前土壤有机质、全氮和碱解氮变化趋势正好相反(图2)。

图2 不同种植年限苜蓿地土壤细菌群落相对丰度前十的细菌门Fig.2 The first ten phylum of soil bacterial community in alfalfa field with different cultivation years

2.3.2 各样地细菌群落在目水平上的组成和相对丰度 目水平上细菌群落相对丰度前十的分析结果表明, 相对丰度占比由高到低分别为unidentified_Gammaproteobacteria (18%)、壳聚糖目(Chitinophagales) (7%)、 unidentified_Acidobacteria (6%)、梭菌目(Clostridiales) (3%)、粘球菌目(Myxococcales) (5%)、单胞菌目(Gemmatimonadales) (4%)、噬纤维菌目(Cytophagales) (4%)、假单胞菌(Rhizobiales) (3%)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales) (3%)、黄色单胞菌目(Xanthomonadales) (3%), 共占细菌总数56%。Unidentified_Gammaproteobacteria为目水平上优势菌, 占了丰度前十菌群数的27%, 其余各菌所占比例较为均匀(图3)。

图3 不同种植年限苜蓿地土壤细菌群落相对丰度前十的细菌目Fig.3 The first ten order of soil bacterial community in alfalfa field with different cultivation years

2.4 不同种植年限苜蓿地土壤细菌群落多样性分析

2.4.1 多样性指数分析 不同种植年限苜蓿地土壤细菌多样性指数分析结果表明, Shannon多样性指数、Chao1指数和ACE指数在种植1年苜蓿地最大, 分别为10.06、5157.33和5261.06, 其中Shannon多样性指数与其他各年限之间均无显著性差异, Chao1指数与ACE指数表现为1 yr与2和6 yr间均存在显著性差异, 从大到小依次为1 yr> 5 yr> 4 yr> 3 yr> 2 yr> 6 yr (表3)。

表3 细菌多样性指数特征 Table 3 characteristics of bacterial diversity index (mean± SD, n=3)
2.5 土壤环境因子与土壤细菌群落组成相关性分析

对土壤环境因子与土壤细菌门水平下丰度进行 Spearman相关性分析, 结果表明碱解氮、全氮和有机碳与一部分细菌门类存在显著和极显著相关性。有机碳与Candidatus_Magasanikbacteria、Candidatus_Yanofskybacteria具有极显著负相关关系, 与Hydrogenedentes、Candidatus_Peregrinibacteria、Melainabacteria具有显著负相关关系; 碱解氮与Candidatus_Peregrinibacteria具有极显著负相关关系, 与Candidatus_Yanofskybacteria、Parcubacteria具有显著负相关关系; 全氮与螺旋原虫门(Spirochaetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、无壁细菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)具有显著正相关关系, 与浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)具有显著负相关关系。全磷、电导率和pH与个别细菌门类存在显著相关性(图4)。

图4 土壤环境因子与细菌门水平相关性
* 表示显著相关(P< 0.05), * * 表示及显著相关(P< 0.01)。
Fig.4 Correlation between soil environmental factors and bacterial level
* represents significant correlation at P< 0.05 level, and * * represents significant correlation at P< 0.01 level.

2.6 土壤细菌群落间的主成分分析

主成分分析是一种对多维数据进行降维, 从而提取出数据中最主要的元素和结构的方法。应用PCA分析能够提取出最大程度反映样本间差异的两个坐标轴, 从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上。样本在图中的距离越接近, 则它们的群落组成越相似。基于OTU水平的PCA分析结果表明, PC1和PC2的贡献率分别为10.63%和9.32%。1和5 yr距离较近, 2和6 yr距离较近, 3和4 yr距离较近, 即这3组间细菌群落组成相似性较高(图5)。

图5 细菌群落间的主成分分析Fig.5 PCA analysis among bacterial communities

3 讨论

通过对6个样本门水平下细菌群落组成和相对丰度分析发现, 苜蓿地土壤中主要有9类细菌, 分别是变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、芽单胞菌门、疣微菌门、浮霉菌门、绿弯菌门。其中郭丽丽等[22]研究发现疣微菌门的消失是油用凤丹牡丹连作障碍形成的重要原因, 而苜蓿地土壤中疣微菌门占细菌总数的3%, 且随着种植年限的增加变化较为稳定, 这可能是苜蓿未出现连作障碍的主要原因。罗明等[23]研究发现芽单胞菌门在黄河三角洲地区含量较高, 为4.74%5.69%, 本研究中芽单胞菌门细菌丰度占比高达6%, 但本研究区位于干旱区, 其占比高可能是因为引用黄河水灌溉的结果。另外变形菌门、放线菌门和酸杆菌门是许多土壤细菌的3大优势门类[24, 25], 且在本研究中发现这3大优势门类随种植年限变化呈现出较为稳定的变化趋势。

土壤中数量众多的微生物既是土壤形成过程的产物, 也是土壤形成的推动者[26], 因此它参与完成土壤中各种复杂的生化反应过程[27]。Alpha多样性可分析样品内菌种类别的丰富度和菌种数目的均匀度, Alpha多样性越高, 细菌种类越丰富, 群落越稳定[22]。本研究结果表明, Shannon指数并无显著性变化, 说明样地土壤细菌群落均匀度较高, 这与细菌群落结构组成具有相同特征, 可能的原因是样地为人工草场, 具有相同的田间管理模式, 因此细菌群落具有较好的均匀性。本研究Chao1指数和ACE指数以及物种丰度(稀释曲线)随着种植年限的递增出现先减小后增大的变化率, 即说明连作会导致细菌丰富度和多样性下降, 这与韩亚飞等[28]研究所得结果一致, 并且在降低到一定程度又会有所回升, 在第5年时达到最大值, 南丽丽等[29]的研究结果支持这一结论。导致细菌群落丰富度和多样性回升的可能原因是随着种植时间的增加, 土壤表面凋落物累积增多, 从而导致土壤养分的回升, 进而导致细菌群落丰富度和多样性增大。对各样本细菌群落间进行主成分分析表明, 土壤细菌群落多样性变化可能存在一个周期性规律, 但由于研究时间只有6年, 对周期持续时间研究缺乏数据支持, 因此具体周期变化需要后续工作进一步验证。

大量研究表明, 土壤细菌多样性与土壤理化性质密切相关[30, 31]。本研究将土壤理化指标与门水平下细菌组成进行Spearman相关性分析得到, 有机碳与5类细菌呈显著负相关关系, 与其中两类呈极显著负相关关系, Liu等[32]发现中国东北黑土的细菌多样性和有机碳呈负相关关系, Sul等[33]研究发现, 有机碳含量低可能是导致微生物多样性低的原因。硝化螺旋菌门参与土壤硝化[34], 本研究发现硝化螺旋菌门与土壤全氮具有显著相关性。同时, 紫花苜蓿共生固氮菌及其固氮能力的研究是土壤微生物学中的一个重要组成部分。在种植第二年的时候土壤碱解氮含量降到最低, 可能原因是在生长前期, 紫花苜蓿需从土壤中吸收大量的氮素[35]。随着种植年限的增加土壤氮素含量又呈现缓慢上升趋势, 这与豆科植物的固氮作用有很大关系, 因此看来在一定阈值内, 紫花苜蓿种植年限越长对土壤的改良效果越好; 全氮、碱解氮也有不同程度增加, 这与有关研究结论一致[36, 37]。综合来看, 土壤理化性质与土壤细菌之间确实存在一种互相反馈机制, 且种植年限为5年时紫花苜蓿土壤养分和微生物环境同时达到最佳水平, 但这种现象会呈周期性循环还是5年以后会持续下降需要进一步研究。

4 结论

变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和放线菌门是不同种植年限苜蓿地土壤优势菌群, 酸杆菌门与土壤全氮具有极显著正相关关系, 放线菌门与土壤全氮具有显著正相关关系; Shannon指数随着种植年限增加无显著性变化, 种植时间为16年的紫花苜蓿地土壤细菌多样性组成相似性高, 且群落优势菌群不受种植时间的影响; 土壤养分和土壤细菌群落组成及丰度都在种植5年时达到最大, 土壤有机碳、碱解氮、全氮是影响细菌群落组成的主要环境因子。

The authors have declared that no competing interests exist.

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