KT/HAK/KUP属于APC(amino acid-polyamine-organocation)超级家族, 广泛存在于原核生物、真菌和高等植物中, 在低等植物如小立碗藓(Physcomitrella patens)和蕨(Selaginella moellendorffii)中也普遍存在^[4]。该家族中的基因被不同研究者以不同的缩写命名, 包括KT, HAK和KUP。植物中最早克隆到的KT/HAK/KUP成员是大麦HvHAK1^[5]和拟南芥AtKUP1/KT1, AtKUP2/KT2^[6]。之后, 从玉米、甜椒(Capsicum annuum)、冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、葡萄和番茄等植物中陆续克隆到该家族成员基因^[7]。拟南芥、水稻、玉米和杨树中分别含有13、27、27和31个该家族成员(表1)^[7]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 KT/HAK/KUP、HKT和Shaker家族的比较 Table 1 Comparison of KT/HAK/KUP, HKT and Shaker family

表1 KT/HAK/KUP、HKT和Shaker家族的比较 Table 1 Comparison of KT/HAK/KUP, HKT and Shaker family

目前, KT/HAK/KUP家族晶体结构的研究尚不清楚, 该家族虽不具有完全相同的功能保守域, 但氨基酸序列中均含有GVVYGDLGTSPLY(加粗字母表示在所有基因中均保守), 疏水结构分析预测表明, 该家族蛋白成员含有10~14个跨膜区域(TM10-TM14)(表1)^[8]。Nieves-Cordones等^[9]从46个被子植物的全基因组测序结果中选出了913个KT/HAK/KUP家族成员, 通过系统进化分析, 可将该家族划分为5个亚族。亚族Ⅰ 成员以拟南芥AtHAK5、水稻OsHAK5和葡萄VvKUP1等为代表; 亚族Ⅱ 成员以拟南芥AtKUP1、AtKUP2、AtKUP3、AtKUP6、AtKUP8等为代表; 亚族Ⅲ 成员以AtKUP9、AtKUP10和AtKUP11等为代表; 亚族Ⅳ 成员以水稻OsHAK4和OsHAK17为代表; 亚族Ⅴ 成员以AtKUP5、AtKUP7和AtKUP12等为代表。亚族Ⅱ 和亚族Ⅲ 成员在双子叶和单子叶植物中的分布都很保守, 亚族Ⅰ 和Ⅳ 的成员则可能在植物适应环境中发挥特殊的作用, 这在双子叶植物拟南芥、葡萄、蒺藜苜蓿和单子叶植物水稻、玉米、短柄草中都可以得到验证^[4]。

KT/HAK/KUP家族成员定位在植物不同细胞器的膜上, 如质膜、液泡膜、类囊体膜等^{[7, 10]}。水稻OsHAK21定位在质膜上, 在木质部薄壁细胞和内皮层细胞中表达^[11]。用融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)方法将水稻OsHAK10瞬时表达在洋葱(Allium cepa)表皮细胞中, 发现它定位在液泡膜上^[12]。拟南芥叶绿体蛋白质组中发现了AtKUP12的存在, 其定位在叶绿体膜上^[13]。同一亚族的家族成员具有并不相同的细胞定位, 可能发挥着不同的细胞生物学功能。如亚族Ⅱ 成员拟南芥AtKUP4定位于液泡膜, 水稻OsHAK2和OsHAK3定位于细胞质膜, 陆地棉GhKT2定位在质膜上^[14], 而OsHAK10则定位于液泡膜。

KT/HAK/KUP家族成员在大多数植物组织中均有表达, 在不同的组织中发挥各自不同的调节作用(表2)。正常生长条件下, 亚族Ⅰ 成员如大麦HvHAK1、水稻OsHAK1和OsHAK5、拟南芥AtHAK5、甜椒CaHAK1、 番茄LeHAK5、 梨(Pyrus bretschneideri)PbrHAK12/16和盐芥(Thellungiella halophila)ThHAK5在植物根和地上部中的表达量较低, 当遭受K⁺饥饿后, 表达水平显著上调^{[15, 16]}。进一步研究发现, 这些成员的表达也受到其他离子如Na⁺和N H4+的调节^[17]。例如, 在100 mmol· L^-1 NaCl处理下, 耐盐芦苇(Phragmites australis)品种中PhaHAK2的转录水平要远高于盐敏感芦苇品种的水平^[18]。冰叶日中花中McHAK1和McHAK3的表达也受NaCl胁迫的诱导^[19]。K⁺饥饿条件下, N H4+能显著诱导大麦HvHAK1和番茄LeHAK5的表达, 却抑制拟南芥AtHAK5和甜椒CaHAK1的表达^{[20, 21]}。其他因素如激素也能参与调控该家族成员基因的表达调控。研究表明, 拟南芥中, AtKUP6受ABA(abscisic acid)诱导^[22]; AtKUP4和AtHAK/KT12的表达受IAA(indole-3-acetic acid)的显著诱导, 但受IAM(indole-3-acetamide)的抑制; AtHAK5受乙烯的强烈诱导^[23], 但受细胞分裂素的明显抑制^[24]。此外, HAK5在番茄和拟南芥中的转录还受N O3-或磷酸盐(Pi)供应的调控^[25]。在植物生长过程中, KT/HAK/KUP家族成员亦能被诱导, 如葡萄浆果表皮生长的过程可以诱导VvKUP1和VvKUP2的表达^[26], 棉花(Gossypium hirsutum)纤维细胞的伸长过程会诱导GhKT1的表达^[27], 后期的生节过程中百脉根(Lotus japonicus)LjKUP表现出了很高的转录水平^[28]。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同高等植物中的KT/HAK/KUP家族成员 Table 2 Members of KT/HAK/KUP family in different plants 转运蛋白 Transporter 亚族 Subfamilies 植物种类 Species 表达部位 Expression tissues 功能 Functions 参考文献 References AtHAK5 Ⅰ 拟南芥A. thaliana 根Root K+吸收K+ uptake [23, 31, 34] HvHAK1 Ⅰ 大麦H. vulgare 根Root K+吸收K+ uptake [12, 43] OsHAK1 Ⅰ 水稻O. sativa 根、叶Root, leaf K+吸收K+ uptake [38] OsHAK5 Ⅰ 水稻O. sativa 根、茎、叶、果实Root, stem, leaf, fruit K+吸收; K+转运K+ uptake, K+ transport [44] OsHAK21 Ⅰ 水稻O. sativa 根、地上部Root, shoot K+吸收; Na+/K+平衡K+ uptake, Na+/K+ balance [11] SiHAK1 Ⅰ 谷子F. millet 根、地上部Root, shoot K+吸收; K+平衡K+ uptake, K+ balance [45] AtKUP2 Ⅱ 拟南芥A. thaliana 根、茎、叶、花Root, stem, leaf, flower K+依赖性细胞扩增K+-dependent cell expansion [22, 29-30] AtKUP4 Ⅱ 拟南芥A. thaliana 根、茎、叶、花Root, stem, leaf, flower K+依赖性细胞扩增; 根系向地性响应; 根毛形成; 调控种子大小K+-dependent cell expansion, root gravitropic responses, root hair formation, control of seed size [29, 34-35, 46] AtKUP6 Ⅱ 拟南芥A. thaliana 根、叶Root, leaf 控制细胞大小; 保卫细胞中K+释放; 侧根形成Control of cell size, K+ release from guard cells, lateral root formation [22, 34] VvKUP2 Ⅱ 葡萄V. vinifera 果实Fruit 浆果表皮细胞扩增Berry skin cells expansion [26] GhKT2 Ⅱ 陆地棉G. hirsutum 根、茎、叶Root, stem, leaf K+吸收; K+转运和分布K+ uptake, K+ transport and distribution [14] HcKUP12 Ⅲ 盐穗木Halostachys caspica 叶Leaf K+吸收(推测)K+ uptake (speculation) [47] AtKUP9 Ⅲ 拟南芥A. thaliana 叶Leaf K+吸收; 铯转运K+ uptake, Cs+ transport [34, 48] GhKT1 Ⅲ 陆地棉G. hirsutum 叶Leaf 棉花纤维伸长Cotton fiber elongation [27] AtKUP11 Ⅲ 拟南芥A. thaliana 根Root 耐盐性Salt tolerance [49] LjKUP Ⅳ 百脉根L. japonicus 根Root 促进共生相互作用Symbiotic interactions [28] PhaHAK5 Ⅳ 芦苇P. australis 根、叶Root, leaf K+吸收; Na+转运K+ uptake, Na+ transport [18] AtKUP7 Ⅴ 拟南芥A. thaliana 根、茎、叶、花、果实Root, stem, leaf, flower, fruit K+吸收和转运K+ uptake and transport [39] AtKUP/HAK/KT12 Ⅴ 拟南芥A. thaliana 叶Leaf 参与光合作用(推测); 调控种子大小Photosynthesis (speculation), control of seed size [46]

表2 不同高等植物中的KT/HAK/KUP家族成员 Table 2 Members of KT/HAK/KUP family in different plants

KT/HAK/KUP转运蛋白在爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中不表达, 因此, 该家族成员的转运特性常用酵母(Saccharomyces cerevisiae)或大肠杆菌(Escherichia coli)等异源表达系统来验证^[29]。KT/HAK/KUP家族成员能够恢复酵母或细菌K⁺吸收缺陷突变体的K⁺吸收能力, 在植物如拟南芥中也已经证明其在维持根和地上部的K⁺稳态平衡过程中起重要作用^{[21, 30]}。该家族成员除能够转运K⁺外, 还能转运Rb⁺、Cs⁺等, 受N H4+调控^{[5, 20]}, 转运H⁺的能力尚需进一步验证。

亚族Ⅰ 成员在该家族中研究最广泛最深入, 已经被证明能参与双子叶和单子叶植物的高亲和性K⁺吸收, 其主要代表为拟南芥AtHAK5、大麦HvHAK1和水稻OsHAK1, 它们能够促进植物根系从外界低浓度K⁺环境中吸收K⁺, 从而适应低K⁺条件下的生长^{[13, 31, 32, 33]}。亚族Ⅱ 成员根据转运特性和生理作用的不同具有功能多样性, 主要代表成员为拟南芥AtKT1/AtKUP1, AtKT2/AtKUP2, AtKT3/AtKUP4/TRH1和大麦HvHAK2。对单子叶植物而言, 亚族Ⅱ 的很多成员经常参与低亲和性K⁺吸收过程, 双子叶植物中此类成员表现出不同的转运活性, 如拟南芥AtKUP6介导低亲和性K⁺吸收^[34], AtKUP4/TRH1介导高亲和性K⁺吸收^[35]。AtKUP1介导兼性K⁺吸收, 在K⁺浓度100~200 μ mol· L^-1时从高亲和性转为低亲和性K⁺吸收^[36]。此外, Na⁺对该家族成员也有不同的影响。部分成员如HvHAK1, PhaHAK2和PhaHAK5可在mmol· L^-1浓度范围内参与Na⁺的转运^{[5, 18]}。抗盐芦苇品种的PhaHAK2-n和PhaHAK2-e均受K⁺饥饿和高盐胁迫的诱导, 可能在盐胁迫下持续发挥K⁺吸收功能, 从而维持体内高K⁺/Na⁺比, 提高芦苇耐盐性^[37]。对AtHAK5或OsHAK1而言, Na⁺对其介导的K⁺吸收有明显的竞争抑制作用^[31]。此外, 虽然OsHAK5与AtHAK5或OsHAK1的同源性很近, 但OsHAK5能够介导对Na⁺不敏感的K⁺吸收^[38]。有关亚族Ⅲ 和Ⅳ 成员的研究报道较少。亚族Ⅲ 的成员AtHAK11可以介导K⁺和Rb⁺的吸收。盐敏感芦苇品种的PhaHAK5-u属于亚族Ⅳ 成员, 在酵母中被证实是高亲和性K⁺转运体, 在Na⁺存在时也参与介导低亲和性Na⁺转运^[18]。亚族Ⅴ 的成员AtKUP7和AtKUP12略有研究, 其中AtKUP7参与K⁺亏缺条件下K⁺的吸收和转运过程, AtKUP12可能参与拟南芥的光合作用过程^[39]。

在拟南芥中, 通过测定野生型和突变体(akt1或athak5)根中Rb⁺(或K⁺)动力学特征, 发现AtHAK5是外界K⁺浓度低于10 μ mol· L^-1下介导K⁺吸收的唯一系统^[40]。此外, 研究发现, 由于AtHAK5对Cs⁺的可渗透性, 在外界低K⁺条件下, AtHAK5能介导Cs⁺进入植物根中引起毒性反应^[41]。亚族Ⅱ 转运蛋白能够影响植物发展过程, 尤其是细胞伸长过程:拟南芥AtKUP4/TRH1在根部和冠部都有大量表达, 其T-DNA插入突变体trh1的根毛伸长明显减缓, 参与植物激素的根特异分布, 影响根尖激素转运蛋白的极性定位, 能建立向地生长和根毛形成的激素梯度^[35]。缺失AtKUP2/SHY3的突变体shy3会引起黑暗处理下地上部生长的缺陷, 表明AtKUP2能够影响细胞的生长, 但具体机制尚不清楚^[30]。拟南芥atkup2/6/8突变体的生长受到促进, 植株的K⁺吸收特征结果表明, AtKUP2、AtKUP6和AtKUP8可能介导K⁺外流, 此外, 该突变体的保卫细胞和侧根细胞中对ABA敏感性的响应降低, 表明KT/HAK/KUP家族成员在植物侧根细胞对激素的敏感性响应过程中有重要作用^[22]。普遍认为, 磷酸化是激活植物KT/HAK/KUP家族转运体活性的主要方式。Osakabe等^[22]的研究发现, AtKUP6能被OST1磷酸化激活, 这表明AtKUP6是参与ABA介导的气孔关闭的调控因子。AtHAK5及其在其他物种中的同源物可被CIPK23/CBL1复合物激活, 捕蝇草(Dionaea muscipula)中也发现了DmHAK5类似的受CIPK23/CBL9复合物激活的现象^[42]。

HKT高亲和性K⁺转运蛋白是广泛存在于真核生物和原核生物中的一类超级蛋白家族, 其中, 植物HKT转运蛋白与真菌和原核生物中Trk/Ktr阳离子转运蛋白家族的同源性很高^[50]。Schachtman等^[51]从小麦中得到的TaHKT2; 1, 是高等植物中的第一个高亲和性K⁺转运蛋白, 后被证实是K⁺-Na⁺共转运蛋白。随后, 研究者相继从不同植物如拟南芥、赤桉(Eucalyptus camaldulensis)、水稻和冰叶日中花等中克隆并鉴定了其同源基因。根据异源表达系统中对Na⁺、K⁺转运特性的不同, HKT可被分为两类:第Ⅰ 类以AtHKT1; 1为代表, 主要转运Na⁺, 如HvHKT1; 1/2, OsHKT1; 2和TaHKT1; 1/2等; 第Ⅱ 类以TaHKT2; 1为代表, 功能是K⁺∶ Na⁺共转运, 包括EcHKT1; 1/2, HvHKT2; 1, OsHKT2; 1, OsHKT2; 2等, 双子叶植物中缺少第Ⅱ 类基因成员^[52]。

Durell等^[53]认为植物HKT蛋白含有4个MPM高度保守结构和1个甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸(GYG)基序, 是由仅有一个MPM结构的原核生物KcsA类K⁺通道经复制加倍及融合进化而来的。按照此模型, 植物HKT类转运体由8个跨膜结构域、4个P环、短的N-末端和C-末端组成, 其中4个MPM结构(1个MPM结构包括2个跨膜螺旋和1个P环)形成四倍径向对称结构, 4个P环与中央的疏水结构形成蛋白的渗透途径, 为该蛋白最狭窄的区域, 作为选择性过滤器(表1)。HKT转运蛋白的结构模型最初是通过序列分析得到的, 后在生化层面得到证实, 最近的原核生物Trk/Ktr类转运蛋白的晶体结构研究为此提供了进一步的证据^[54]。此外, HKT蛋白在P环或其附近有多个K⁺∶ Na⁺选择性吸收位点。HKT的第一个P环过滤器位置处有1个氨基酸残基对其离子转运特性起着调控作用:第Ⅰ 类转运蛋白通常第1个P环中过滤器处为丝氨酸残基(S), 第Ⅱ 类转运蛋白在相应位置处常为甘氨酸残基(G)^[55]。进一步研究发现, 介导K⁺∶ Na⁺共转运的第Ⅱ 类HKT转运蛋白的甘氨酸并非是决定其K⁺选择性吸收特性的唯一氨基酸残基, 因为一些Na⁺特异性转运的第Ⅰ 类HKT蛋白也具有K⁺转运特性, 且赖氨酸和精氨酸也参与调控其K⁺转运活性^[55]。此外, 亚族Ⅰ 大部分成员在第2个P环区域的保守位置氨基酸是谷氨酰胺Asn(N), 当N突变为Asp(D)后, 成员的Na⁺转运特性转变为Na⁺∶ K⁺共转运特性, 这在拟南芥AtHKT1; 1、盐芥TsHKT1; 2及Eutrema parvula EpHKT1; 1中均得到验证^{[56, 57, 58]}。

HKT家族成员定位在根表皮细胞膜及根、茎、叶鞘木质部薄壁细胞膜等处。研究表明, 亚族Ⅰ 成员野大麦HvHKT1; 1、玉米ZmHKT1、水稻OsHKT1; 4定位在木质部薄壁细胞膜上, 拟南芥AtHKT1; 1、番茄SlHKT1; 1和SlHKT1; 2、契斯曼尼番茄(Solanum cheesmaniae)ScHKT1; 1和ScHKT1; 2定位于木质部薄壁细胞的质膜和韧皮部上^{[59, 60, 61, 62]}。Rosas-Santiago等^[63]却发现, 水稻OsHKT1; 3定位在高尔基体上。亚族Ⅱ 成员冰叶日中花McHKT2、水稻OsHKT2; 1和OsHKT2; 2/1均定位在质膜上^{[64, 65]}。

HKT家族成员在不同植物中的表达部位和调控效应不同(表3)。番茄和契斯曼尼番茄中的Sl(Sc)HKT1; 1和Sl(Sc)HKT1; 2在根、茎和叶中均有表达, 当遭受盐胁迫时, 根中Sl(Sc)HKT1; 1和Sl(Sc)HKT1; 2的表达显著上调, 而叶和茎中Sl(Sc)HKT1; 2的表达却下降^[62]。小麦TaHKT2; 1和TaHKT2; 2在叶片、叶鞘和根中均有表达^[66]。水稻、大麦、芦苇、小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)等植物中, HKT2; 1在叶中有高表达, 根中表达量较低^{[51, 56, 57, 67, 68, 69]}。水稻中的HKT家族成员最多, 目前在粳稻品种日本晴(Nipponbare)中鉴定到9个HKT成员, 其中5个为亚族Ⅰ 成员:OsHKT1; 1主要在叶片韧皮部表达, 受盐胁迫的显著诱导, 还受转录因子如MYBc等的调节^[70]; OsHKT1; 3在叶、叶鞘及茎基部维管束中均有表达, 在韧皮部中的表达量很高; OsHKT1; 4主要在地上部维管束组织中表达^[64]; OsHKT1; 5在根部和叶鞘木质部薄壁细胞膜上均有表达, 在成熟叶片韧皮部中也可观测到表达, 受盐胁迫的诱导^[71]。亚族Ⅱ 成员OsHKT2; 1在水稻叶片的维管组织、近轴表皮和叶肉细胞中均可观测到表达^{[64, 72, 73]}。水稻Nona Bokra品种No-OsHKT2; 2/1主要在根中表达, 受外界高Na⁺浓度的显著诱导^[67]。OsHKT2; 3水稻在根、茎基部、叶和叶鞘中均有表达。OsHKT2; 4则在水稻根表皮细胞及茎、节间、叶鞘的维管束木质部和韧皮部中均有表达^[74]。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同高等植物中的HKT家族成员 Table 3 Members of HKT family in different plants

表3 不同高等植物中的HKT家族成员 Table 3 Members of HKT family in different plants

HKT家族亚族Ⅰ 成员多为Na⁺转运蛋白, 但一些成员也具有K⁺转运特性(表3)。拟南芥athkt1; 1突变体中的Na⁺内流不受盐胁迫影响, 但盐胁迫引起体内Na⁺的分配发生改变, Na⁺更多地积累在植株的地上部中, 且地上部中韧皮部Na⁺含量下降, 而木质部Na⁺含量增加^[75]。Zhang等^[76]发现, 枯草芽孢杆菌GB03通过抑制拟南芥根中AtHKT1; 1的表达降低整株的Na⁺积累。最近的研究表明, 盐胁迫下, AtHKT1; 1通过茎中木质部汁液Na⁺的回流, 减少Na⁺向花器官的运输, 从而提高植株的耐盐性^[77]。Busoms等^[78]进一步的研究表明, AtHKT1; 1的演化在拟南芥适应动态变化的盐浓度过程中起着至关重要的作用, 两种具有不同表达模式的AtHKT1; 1是使得各种拟南芥生态型在不同盐浓度条件下生存的最直接因素。可见, AtHKT1; 1参与拟南芥Na⁺的转运及稳态平衡过程。此外, 拟南芥sos3突变体中AtHKT1; 1的突变可显著缓解低K⁺胁迫下sos3根生长受抑的表型, 而AtHKT1; 1的超表达使其生长受抑更为显著, 表明, AtHKT1; 1也可能参与调节植物体内K⁺稳态平衡^[79]。 盐芥TsHKT1; 2与AtHKT1; 1有较高的同源性, 但它仅具有K⁺转运特性, 赤桉EcHKT1; 2与TsHKT1; 2类似。玉米ZmHKT1功能缺失后会引起木质部Na⁺浓度的增加, 导致根向地上部Na⁺转运的增加, 表明ZmHKT1可促进叶中Na⁺的外排及木质部中Na⁺的卸载, 从而维持植株的耐盐性^[61]。Han等^[59]对西藏野生大麦的研究表明, HvHKT1; 1基因的敲除会引起根系和叶片中的Na⁺积累增加, 而将HvHKT1; 1过表达在盐敏感拟南芥hkt1; 4和sos1-12突变株中, 可显著降低根和地上部中的Na⁺含量, 表明, HvHKT1; 1在根中Na⁺的转运过程中发挥重要作用。HKT家族亚族Ⅱ 成员不仅具有K⁺∶ Na⁺共转运特性, 在外界环境的影响下, 还可作为K⁺、Na⁺单向转运体(表3)。小麦TaHKT2; 1属于K⁺∶ Na⁺共转运蛋白, 当外界Na⁺浓度较低时, 同时介导K⁺、Na⁺吸收, 是一种Na⁺藕联的K⁺转运蛋白, 但当外界低K⁺高Na⁺时, 仅介导低亲和性Na⁺吸收^[80]。Laurie等^[81]将TaHKT2; 1以反义方式转进小麦, 在低K⁺和高Na⁺下检测膜的去极化, 发现低K⁺下转基因植株和对照株没有差异, 而高Na⁺转基因植株比对照去极化程度快, 且高Na⁺(200 mmol· L^-1)处理下, 转基因植株体内积累的Na⁺含量降低, 耐盐性远高于对照, 进一步表明小麦根中TaHKT2; 1主要介导Na⁺内流。相似地, 在爪蟾卵母细胞中, 水稻OsHKT2; 1仅在外界毫摩尔Na⁺(mmol· L^-1)浓度范围内发挥Na⁺∶ K⁺共转运活性, 当外界Na⁺浓度较高时, 只转运N a+[72, 68]。然而, 在酵母中表达时, OsHKT2; 1仅表现出转运Na⁺的特性^[67]。水稻缺失OsHKT2; 1的突变体中²²Na⁺同位素吸收实验发现, 与野生型对比, 突变体中根系Na⁺内流明显下降, 且30 mmol· L^-1 Na⁺处理使OsHKT2; 1调节的Na⁺内流下降, 同时其表达水平相应下调, 表明OsHKT2; 1参与Na⁺的吸收和转运, 是高亲和性Na⁺转运蛋白, 对K⁺有较强的敏感性^[82]。水稻OsHKT2; 1和OsHKT2; 2的氨基酸序列同源性高达91%, OsHKT2; 2被证明是K⁺∶ Na⁺共转运蛋白。在耐盐水稻品种(Nona Bokra)中鉴定到的OsHKT2; 2/1, 在酵母和爪蟾卵母细胞中表达, 具有很强的K⁺∶ Na⁺共转运特性, 在盐胁迫下可能参与K⁺的选择性吸收, 使得Nona Bokra具有较强的耐盐性^[67]。类似地, 芦苇PhaHKT2; 1参与盐胁迫下K⁺吸收的调控, 控制体内离子平衡^[83]。此外, Rosas-Santiago等^[63]发现, OsHKT1; 3和OsCNIH1的编码蛋白在内质网互作, 介导从内质网向高尔基体的物质运输。Zhang等^[74]的研究进一步表明, 高亲和性K⁺转运蛋白OsHKT2; 4可作为低亲和性Mg²⁺转运蛋白参与高浓度Mg²⁺条件下的Mg²⁺转运过程。

Shaker家族是第一个在分子水平上被确定的植物K⁺通道, 它是通过酵母吸钾双突变体互补法从拟南芥cDNA文库中分离出来的^{[91, 92]}。Sentenac等^[91]和Anderson等^[92]从拟南芥中首次克隆到K⁺通道基因KAT1和AKT1。Ché rel等^[93]进一步分析发现, KAT1和AKT1与动物K⁺通道的功能和结构相似。Shaker家族可划分为5个亚族^[94]。亚族Ⅰ 和Ⅱ 由5个内整流K⁺通道组成(AKT1, SPIK, AKT6, KAT1和KAT2), 亚族Ⅰ 和Ⅱ 的成员可通过结构上是否含有锚蛋白区和C末端得以区分。亚族Ⅲ 由单一的成员AKT2组成, 含有锚蛋白区。亚族Ⅳ 由单一成员AtKC1组成, 不含锚蛋白区域。亚族Ⅴ 由两个外整流K⁺通道GORK和SKOR组成, 受激活的电压范围和整流特性与内整流通道相反, 含有锚蛋白区域。

Shaker通道是多亚基蛋白, 由4个ɑ -亚基组成。在四聚物结构中, 这4个亚基可以是一个Shaker基因的产物, 也可以是不同Shaker基因的产物。这些亚基拥有确定的位置, 每一个亚基由6个跨膜结构(TM1-TM6)组成疏水区域, 含有N-和C-末端区域^[91]。TM5和TM6之间含有一个高度保守呈β 发夹状的P环结构。P环结构作为离子介导中心选择性过滤区域, 其所特有的TxxTxGYGD/E正是K⁺通道标志性序列, 该结构对于K⁺具有高度选择性(表1)^[93]。TM4由带正电荷的氨基酸残基组成, 能感应跨膜电压的变化, 进而控制内整流K⁺通道的开闭^[95]。C-末端在胞质内, 主要由环核苷酸结合区域(cNMP)、锚蛋白(ankyrin)重复域和富含疏水酸性残基区(KHA domain)组成^[96]。

Shaker家族大部分成员均定位在质膜上。亚族Ⅰ 的成员如拟南芥AtAKT1、霸王(Zygophyllum xanthoxylum)ZxAKT1、葡萄VvK1.1、番茄LKT1、胡萝卜(Daucus carota)DKT1、盐地碱蓬(Suaeda salsa)SsAKT1等均定位在根的质膜上, 并主要在根表皮细胞中表达^{[17, 97]}(表4)。在其他部位也可发现该亚族成员Ⅰ 的表达, 如在下胚轴、叶原基细胞、水孔和保卫细胞中可观测到AtAKT1的表达^[98], 在葡萄的根皮层、花、果实和种子中都有VvK1.2表达^[99], 从玉米胚芽鞘中分离出的ZMK1, 在根皮层、花粉中也均有表达^[100]。然而, AtSPIK和AtAKT6主要在拟南芥花中表达, 马铃薯(Solanum tuberosum)SKT1却仅在保卫细胞中表达^{[101, 102]}。霸王ZxAKT1优先在根中表达, 受介质中高浓度KCl或NaCl的诱导^[103]。亚族Ⅱ 的成员拟南芥AtKAT1定位在子叶和下胚轴的保卫细胞中, 在黄化下胚轴皮层、表皮和花茎中也有分布, 而AtKAT2特异地分布在子叶和黄化幼苗顶端的韧皮部中, AtKAT1和AtKAT2的表达均受植物激素的显著诱导。类似地, 甜瓜(Cucumis melo)MIRK、玉米ZmK2.1和KZM2等^[4]亚族Ⅱ 的成员特异地表达在韧皮部中, 在植物的地上部组织中(如茎、叶和花)表达。亚族Ⅲ 的成员几乎都在韧皮部表达, 如拟南芥AtAKT2、蚕豆(Vicia faba)VFKT1和杨树PTK2等^{[101, 104]}。单子叶植物中, 关于亚族Ⅲ 基因成员表达模式分析的研究报道很少, 其中玉米ZMK2被报道在胚芽鞘、中胚轴和叶中表达, 也表现出韧皮部的表达特性^[105]。除了拟南芥AtKC1, 在胡萝卜中也已经鉴定到KDC1, 这两个基因都属于亚族Ⅳ 成员, 在根皮层尤其根毛中有高表达^{[106, 107]}。亚族Ⅴ 的成员具有不同的表达模式, 如拟南芥AtSKOR在根中柱组织和花粉中表达^[102]; 拟南芥AtGORK则在保卫细胞、根毛和下胚轴中表达^[108]; 玉米ZORK在保卫细胞中表达^[109]; 杨树PTORK在保卫细胞、叶片木质部中都观察到了表达^[110]; ZxSKOR在霸王的根、茎和叶中都有表达, 其中在根中的表达量最高, 受Na⁺的显著诱导^[111]。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同高等植物中的Shaker家族成员 Table 4 Members of Shaker family in different plants

表4 不同高等植物中的Shaker家族成员 Table 4 Members of Shaker family in different plants

Shaker选择性K⁺通道受电压调控, 根据受激活的电压范围及整流特性, 可分为3类:内向整流通道(inward rectifier, IR)(包括Ⅰ 、Ⅱ 亚族)、弱内向整流通道(weak inward rectifier, WIR)(包括第Ⅲ 亚族)和外向整流通道(outward rectifier, OR)(包括亚族Ⅴ )^[112]。亚族Ⅰ 和Ⅱ 成员受反向电压激活, 具有低K⁺转运亲和性, 且大部分成员的K⁺转运活性受pH值调节, 外部介质的酸化会增加电流水平和电导率^[93]。亚族Ⅰ 的一些成员允许N H4+进入, 尤其在低K⁺环境中这种渗透性会引起N H4+和K⁺的竞争性吸收^[113]。研究表明, 拟南芥SPIK和水稻OsAKT1均表现出重要的N H4+渗透能力^{[102, 112]}。对亚族Ⅱ 的3个成员进行分析, 发现胞质内的pH酸化会增加电流, 从而改变通道被激活的阈值^[114]。亚族Ⅲ 的成员需要外界供K⁺来激活通道, Rb⁺或Cs⁺在一定程度上可代替K⁺。该族成员也对pH敏感, 但不同于亚族Ⅰ 和Ⅱ 的是, 外界酸化会降低K⁺电流和电导率, 如拟南芥AtAKT2, 杨树PTK2, 玉米ZMK2^{[105, 115]}。此外, 外界高浓度的Ca²⁺会引起亚族Ⅲ 成员的电压依赖受阻^[115]。亚族Ⅳ 在功能上被认为是“ 沉默型” 调控亚族, 目前仅拟南芥AtKC1和萝卜KDC1完成了功能鉴定^{[116, 117]}。实际上, AtKC1自身不具有K⁺通道活性, 成员虽不能通过相互作用形成质膜多聚体通道, 却可作为负向调控元件, 与亚族Ⅰ 、Ⅱ 和Ⅲ 的成员一起形成内整流杂聚肽通道^[118]。与自身通道相比, 与其他成员形成杂聚肽通道的电压激活阈值为反向, 且最大电导率都比对应的同聚体低, 从而降低AKT1的电压依赖性进而抑制AKT1介导的K⁺内流^[118]。拟南芥突变体中用电压钳分析表明, AKT1同聚体对Rb⁺的渗透性极其微弱, 然而AtKC1-AKT1杂聚肽通道则相反, 表明AtKC1亚单元在杂聚肽通道中出现时会影响通道的离子选择性^[119]。Wang等^[120]的电生理结果表明, 在拟南芥响应低K⁺的过程中, 与野生株相比, AtKC1^D突变体(功能获得性突变体, K⁺吸收能力提高)中AtAKT1活性被抑制, 通过AtAKT1渗出的K⁺显著降低, 进一步揭示, 在低K⁺条件下, AtCIPK和AtKC1协同调控AtAKT1介导的K⁺吸收。KDC1在调控Zn²⁺内流中作为正向调控元件, 但和亚族Ⅱ 的KDC2组成的复合体却能负向调控通道激活电压阈值^[117]。除亚族Ⅳ 外, 其他亚族自身或互相作用也能构成杂聚肽通道, 且与四聚体相比, 优先形成杂聚肽通道, 如拟南芥中, 保卫细胞中的亚族Ⅱ 成员AtKAT1和AtKAT2, 韧皮部细胞中的亚族Ⅲ 成员AtAKT2和AtKAT2^{[121, 122]}。亚族Ⅴ 对外界K⁺具有很强的电压门控敏感性, 其激活的电压阈值受K⁺平衡潜能Ek影响, 根据轻微的反向膜电压确定, 确保通道正常释放K⁺。亚族Ⅴ 成员具有较低的离子选择吸收能力。拟南芥AtSKOR通道中, K⁺、Cs⁺和Rb⁺都可以调控通道激活阈值, 允许外界低浓度Ca²⁺的大量通过^[123]。杨树PTORK和烟草(Nicotiana tabacum)NTORK1可介导除K⁺外的其他离子通过通道^{[115, 124]}。虽然亚族Ⅴ 的成员是否能在相同组织中共同表达尚不清楚, 至少拟南芥AtSKOR和AtGORK可以相互作用形成杂聚肽通道^[125]。

很多研究表明, 大量调控因子参与质膜中植物Shaker通道的调控或活性激活过程, 包括β -亚基、14-3-3蛋白、不同种类的激酶、磷酸酶和SNAREs等^[1]。拟南芥中, 应对盐胁迫和K⁺缺失的信号网络中, 有26个丝氨酸/苏氨酸CIPKs(protein kinases)和10个CBLs(calcineurin B-like)参与植物对环境信号的响应^[10]。Ca²⁺与CBLs的结合需要CIPK-CBL的相互作用才能完成。上游的CBL1和CBL9可与CIPK23相互作用, 将CIPK23锚定于细胞质膜上, 随后CIPK23对Shaker K⁺通道AKT1进行磷酸化, 激活AKT1的K⁺转运活性, 促进植物在低K⁺条件下吸收 K+[126]。Lee等^[127]进一步发现, 由AKT1介导的K⁺吸收还受CBL1、CBL2、CBL3、CBL9与CIPK家族(CIPK6和CIPK16的锚蛋白结合域)相互作用的调控。研究发现, 爪蟾卵母细胞中, CIPK-CBL复合体能够通过控制AKT1的磷酸化状态调节AKT1的活性。最近的研究表明, AtKC1和AtCIPK23协同调控拟南芥低K⁺条件下AKT1的活性^[128]。AKT2也受磷酸化和去磷酸化的调节, AKT2的磷酸化状态对其通道活性至关重要, 磷酸化可显著增强其在韧皮部介导K⁺转运的能力, 参与该磷酸化过程的蛋白激酶仍不清楚^[129]。CBL4-CIPK6复合体可通过促进AKT2锚定在质膜上从而调节AKT2的活性, 与AKT1通道不同, 该过程依赖激酶的相互作用, 不受磷酸化调节^[130]。爪蟾卵母细胞中表达亚族Ⅰ 成员时, 共同表达拟南芥CIPK23-CBL1(CBL9)复合体可使该通道从静默状态被激活^[131]。杨树PeCIPK24和PeCBL1可以互相作用, 影响通道的锚蛋白区域和CIPK的激酶区域^[127]。葡萄中, 两个不同的CIPK-CBL复合体(VvCIPK04和VvCBL01, VvCIPK03和VvCBL02)均诱导了VvK1.2的转运活性^[99]。可见, 亚族Ⅰ 通道受CIPK-CBL复合体调控的机制在不同植物种类中均很保守。

相同亚族成员在不同的植物种类中具有不同的生理功能。Ahmad等^[132]对比了水稻OsAKT1缺失突变体和超表达突变体后发现, OsAKT1的过表达可以显著增加水稻组织中尤其是根中的K⁺含量, 从而提高水稻的渗透调节能力, 以抵御干旱胁迫。经异源表达系统鉴定, 玉米ZmK2.1受外界K⁺浓度的强烈调节, 与膜的超级化无关, 在外界Km值15 mmol· L^-1左右时转运活性被激活, 无论膜电位如何, 均不参与亚微摩尔级的K⁺吸收^[133]。研究表明, 玉米保卫细胞中还存在如ZMK2类不受外界K⁺浓度影响的内整流K⁺通道, 这样玉米保卫细胞可在较大的K⁺浓度范围内对K⁺产生响应^[134]。然而, 拟南芥的保卫细胞中仅有KAT1内整流K⁺通道基因表达。可见, 不同植物保卫细胞中内整流K⁺通道的多样性会引起它们功能方面产生很大差异。耐盐甜瓜品种中, 内整流K⁺通道MIRK在保卫细胞中表达, 其介导的K⁺电流受外界Na⁺的抑制, 从而影响盐胁迫下的K⁺转运^[135]。此外, MIRK可能通过Na⁺引起的气孔开闭控制Na⁺向地上部组织中的运输, 表明内整流K⁺通道可能参与保卫细胞中除调控气孔开闭以外的其他重要生理过程^[136]。