引用本文
姜妍, 薛恩玉, 鹿文成, 崔国文, 李远明, 韩天富, 王绍东. Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系培育及其饲草价值分析. 草业学报, 2020,29(10): 91-98
JIANG Yan, XUE En-yu, LU Wen-cheng, CUI Guo-wen, LI Yuan-ming, HAN Tian-fu, WANG Shao-dong. Breeding and feeding quality analysis of a new soybean strain deficient in Kunitz trypsin inhibitor. Acta Prataculturae Sinica,2020,29(10): 91-98  
Doi:10.11686/cyxb2019547
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Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系培育及其饲草价值分析
姜妍1,2, 薛恩玉3, 鹿文成4, 崔国文5, 李远明1,2, 韩天富6, 王绍东1,2,*
1.东北农业大学农学院,大豆生物学教育部重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150030
2.黑龙江省绿色食品科学研究院,国家大豆工程技术研究中心,黑龙江 哈尔滨 150028
3.黑龙江省绿色食品发展中心,黑龙江 哈尔滨 150036
4.黑龙江省农业科学院黑河分院,黑龙江 黑河 164300
5.东北农业大学动物科技学院,黑龙江 哈尔滨 150030
6.中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081
*通信作者. E-mail: wsdhlj@neau.edu.cn

作者简介:姜妍(1979-),女,吉林辽源人,副研究员,博士。E-mail: yanjiang416@163.com

收稿日期: 2019-12-16
基金项目:科技部“十三五”七大作物育种专项(2017YFD0101306-05)和国家大豆良种重大科研联合攻关项目(19190479)资助
摘要

大豆作为饲料蛋白质的重要来源,既含有丰富的营养成分,也有影响蛋白质消化吸收的胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子。本研究以合丰50为母本,中黄16为父本,通过常规杂交育种及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子辅助育种技术,经过多年选育,获得适合黑龙江省栽培的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失稳定遗传的大豆新品系“HZ8009”。该品系生育期120 d,植株高大茎叶繁茂,无限结荚习性,籽粒蛋白质含量42%,脂肪含量20%。利用饲草质量检测技术对高代品系“HZ7009”植株饲草营养价值分析表明,与牡丹江秣食豆相比,“HZ7009”干草产量高21.39%,干物质中粗蛋白质含量高3.92%,且最佳刈割时期为花期至结荚期。大豆新品系“HZ8009”具有高蛋白、高生物量的特性,可作饲草资源品种加以广泛利用。

关键词: 大豆; Kunitz型胰蛋白酶抑制剂; 营养价值
Breeding and feeding quality analysis of a new soybean strain deficient in Kunitz trypsin inhibitor
JIANG Yan1,2, XUE En-yu3, LU Wen-cheng4, CUI Guo-wen5, LI Yuan-ming1,2, HAN Tian-fu6, WANG Shao-dong1,2,*
1.College of Agriculture, Key Laboratory of Soybean Biology Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
2.Heilongjiang Green Food Science Institute, National Soybean Engineering Technology Research Center, Northeast Agricultural University, Harbin 150028, China
3.Heilongjiang Green Food development Center, Harbin 150036, China
4.Heihe Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Heihe 164300, China
5.Animal Science and Techonology college, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
6.Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
*Corresponding author. E-mail: wsdhlj@neau.edu.cn
Abstract

As a source of feed protein, soybean contains rich nutritional components, but also have trypsin inhibitors that affect protein digestibility and absorption. Through conventional breeding and Native-PAGE molecular assisted breeding technology, a new soybean strain ‘HZ8009’ deficient in Kunitz type trypsin inhibitors was selected, with Hefeng50 as the female parent and Zhonghuang16 as the male parent. The new soybean strain HZ8009 is suitable for cultivation in Heilongjiang Province and has a maturity time of 120 days. The plant is tall with luxuriant foliage and an indeterminate podding habit. The protein content of the seed is 42%, and the fat content is 20%. The feed nutritional value of advanced generation strain was analyzed using feed quality testing technology. Hay yield was 21.39% greater and the dry matter crude protein content was 3.92% greater than for Mudanjiang fodder soybean. The best cutting period was from flowering to podding. The new soybean strain HZ8009 has a high protein content and high crop biomass, indicating wide potential for use as a forage resource.

Keyword: soybean; Kunitz trypsin inhibitor; nutritive value

大豆(Glycine max)是营养价值丰富的作物, 蛋白质含量约为40%, 经压榨或浸提后的豆粕粗蛋白含量可达44%左右, 不但是人类植物蛋白质和食用油的重要来源, 还是畜牧养殖中畜禽饲料最主要的蛋白质来源。Hackleman[1]认为广泛种植的栽培大豆是最好的一年生饲料作物, 茎秆直立, 营养价值高, 可替代部分精饲料。但是, 大豆中天然存在一些抗营养因子, 影响有益营养成分的消化、吸收和代谢, 对人类健康和动物生产造成了不良影响。其中, 大豆胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitors, TIs)是抗营养因子中常见的一种, 胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶及糜蛋白酶结合, 造成内源性氮和机体含硫氨基酸的大量损失, 氨基酸代谢不平衡, 降低蛋白质的消化率。在饲料加工业上, 它的有害作用主要是抑制动物生长, 胰腺肿大, 生产性能下降[2]。减少胰蛋白酶抑制剂对畜禽的危害以及降低胰蛋白酶抑制剂活性的研究亦是国内外普遍关注的问题[3]。在饲料生产和畜禽饲养中, 高蛋白质饲料亏缺, 可替代植物性蛋白的缺乏, 使得大豆或豆粕作为饲料的研究和利用就显得尤为重要和紧迫。

植物中的胰蛋白酶抑制剂, 在植物的贮藏器官种子或块茎中含量较高, 约占总蛋白的10%[4], 大豆种子中胰蛋白酶抑制剂含量约占总蛋白的6%。大豆中胰蛋白酶抑制剂的活性最高, 种类约有7~10种, 其中研究较多的两种类型分别是Kunitz型胰蛋白抑制剂(Kunitz type tyrpsin inhibitor, KTI)和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk type trypsin inhibitor, BBTI)[5]。大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂(SBTI-A2)大量存在于大豆种子中, 由 4个显性等位基因Tia, Tib, Tic及Tid编码, 其中Tia在自然界中普遍存在[6]。大豆胰蛋白酶抑制剂具有热不稳定性, 在食品加工和饲料加工上往往采用加热处理进行去除或降解, 但现有加热处理技术不但存在去除不彻底问题, 同时还存在加热处理过程中造成其他蛋白质的破坏, 降低了大豆营养品质和转化效率, 因此, 培育胰蛋白酶抑制剂缺失的大豆新品种(系)成为解决以上问题的最佳途径。本研究以提高大豆籽粒营养价值为目的, 培育适合东北地区种植的胰蛋白酶抑制剂缺失大豆品种, 并与豆科饲草进行营养对比试验, 探索胰蛋白酶抑制剂缺失大豆作为饲草资源的可行性。

1 材料与方法
1.1 实验材料

杂交组合为合丰50(♀)和中黄16(♂), 中黄16为缺失Kunitz型胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶-2.3基因的黄淮海地区夏大豆品种, 由中国农业科学院作物科学研究所提供。对照品种之一为牡丹江秣食豆(Mudanjiang fodder beans), 由东北农业大学动物科学技术学院提供。杂交组合后代高代株系用于农艺性状记载和品质分析。

1.2 实验设计

1.2.1 Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失品系培育 以黑龙江省主栽的高产优质大豆品种合丰50作为母本, 中国农业科学院培育的蛋脂双高、Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失的夏大豆中黄16作为父本, 进行花期错时播种, 人工杂交, 从F2代开始进行胰蛋白酶抑制剂缺失检测的分子辅助选育, 重组自交系世代稳定后进行抽样分子辅助检测, 确定缺失Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的品系, 并对性状稳定的优良株系进行植株特征和种子特性的世代跟踪观测。

1.2.2 品系植株的饲草品质分析 2015年5月在哈尔滨市农业科学院试验田进行杂交后代重组自交系“ HZ7009” 的饲草品质分析试验, 参照品种为牡丹江秣食豆和杂交父本中黄16, 采用大区对比试验, 取样时期为花期、结荚期、鼓粒初期和中期, 每个品种取5株, 混合测定其植株的干鲜重和植株含水量, 取单株平均值, 每个处理重复3次。烘干粉碎测定各个品种各处理饲草饲用品质, 包括粗蛋白(crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗纤维(crude fibre, CF)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)、粗灰分(crude ash, CA) 含量等, 每个处理重复3次。

1.3 试验方法

1.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 采用微量提取法[7]提取大豆单粒种子中的蛋白, 在大豆胚轴的相反侧, 用刀片切取种子细粉6~8 mg, 放入1.5 mL 的离心管, 加入300 μ L提取缓冲液, 提取缓冲液为0.1 mol· L-1Tris-HCl, pH 8.0, 溴酚蓝指示剂适量, 蛋白样品浓度为20 mg· mL-1, 用振荡器搅拌均匀, 超声波萃取5 min, 用4 ℃高速离心机8000 r· min-1离心10 min, 取上清液20 μ L用于12%~4%不连续非变性聚丙烯酰胺(Native-PAGE)电泳解析[8], 胰蛋白酶抑制剂标样浓度为2 mg· mL-1。用微量注射器抽取试样慢慢注入进垂直胶板中各泳道。电泳条件: 电压100 V, 电泳时间1 h左右, 待指示剂通过浓缩胶后, 将电压升至180 V, 电泳时间4 h左右停止电泳, 取下胶体, 放入染色液, 轻摇染色1 h, 取出放入脱色液, 轻摇脱色4 h以上。通过凝胶成像仪, 分析种子中KTI型胰蛋白酶抑制剂的缺失情况, 明确自交系后代中KTI型胰蛋白酶抑制剂缺失籽粒, 进行后代选育。

1.3.2 营养品质指标测定 将各取样时期的整株鲜样进行105 ℃杀青15 min后, 65 ℃烘干至恒重, 粉碎机粉碎通过1 mm筛备用。CP釆用凯氏定氮法测定; EE釆用索氏乙醚浸提法测定; CF采用酸碱消煮法测定; NDF和ADF用快速检测法; CA采用灼烧法测定, 无氮浸出物(nitrogen-free extract, NFE), NFE%=100%-CP%-EE%-CA%-CF%, 各指标测定方法操作均参照张丽英[9]的《饲料分析及饲料质量检测技术》。

1.4 数据分析

利用BIO-RAD ChemiDoc XRS+凝胶成像仪分析软件扫描图像分析, 利用Excel表进行品质数据整理和分析, 用DPS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析
2.1 胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系的选育

2.1.1 基于Kunitz胰蛋白酶抑制剂检测的生化检测辅助选择 2011年在国家大豆工程技术研究中心大棚温室内获得杂交种F1代种子25粒, 自交的F2代种子胰蛋白酶抑制剂缺失的遗传性状发生分离, 单株缺失性状检测, F2代种子每个单株随机抽取24粒, 经Native-PAGE电泳检测后, 统计Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失种子比例约占被检测种子的25%。花期植株形态调查, Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失的F2代种子叶形发生分离, 尖叶占20%, 接近于母本, 圆叶占80%, 接近于父本, 叶形与胰蛋白酶抑制剂缺失与否无关联。F3代种子收获后, 不同植株或同一植株的大豆种子的种脐颜色均有差异, 共有黑色、浅黑、褐色、黄色4种颜色。种脐颜色与叶色形态存在一定相关性, 遗传于母本的黄色种脐的大豆植株占全部的20%, 其余种脐颜色的大豆植株占全部的80%。同一植株的大豆种子的种脐颜色也会发生分离, 同一株中黑色和浅黑色种脐的大豆种子所占比例较大, 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果的比对(图1), 大豆种脐颜色与Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失与否无一定的相关性。自交系F4及F5代种子检测结果均未含有Kunitz型胰蛋白酶抑制剂, 缺失Kunitz型胰蛋白酶抑制剂的性状从F4开始稳定遗传。

图1 F3代种子Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失检测
K为Kunitz型胰蛋白酶抑制剂标准样品; 1为合丰50, 2为中黄16; 3~8为F3代随机选取的种子样品, 其中5、6为缺失胰蛋白酶抑制剂的种子样品, 3、4、7、8为含有胰蛋白酶抑制剂的种子样品。Fig.1 Detection of deletion of Kunitz trypsin inhibitor in F3 seeds
K is the standard sample of Kunitz trypsin inhibitor; 1 is Hefeng50, 2 is Zhonghuang16; 3-8 are seeds through random selection, 5 and 6 are seeds with deletion of Kunitz trypsin inhibitor, 3, 4, 7 and 8 are seeds with Kunitz trypsin inhibitor.

2.1.2 植物学特征观察和种子特性分析 通过Native-PAGE电泳辅助育种技术, 选育出Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失的自交系稳定株系3份, 对植株特性表现优良的一份自交系“ HZ08-9” 从F4代开始进行植物学特征观测, 包括植株特性, 生长特征及种子特性等方面。该品系植株株高88~91 cm, 分枝数为3~4个, 收敛型株型, 单株荚数76~80个, 单株粒数176~195个, 紫花, 圆叶, 最大茎叶比在鼓粒中后期, 为1.79, 花期56~58 d, 无限结荚习性(表1)。黄色种脐和种皮, 百粒重25.00 g, 蛋白质含量42.00%, 脂肪含量20.03%, 各世代种子中均无Kunitz型胰蛋白酶抑制剂。自“ HZ08-9” F7代后命名该品系为“ HZ7009” 。

表1 HZ08-9植株特征和种子特性 Table 1 Plant and seed characteristics of HZ08-9
2.2 胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系饲草品质分析

2.2.1 生物量比较 以豆科饲草植物牡丹江秣食豆和胰蛋白酶抑制剂缺失的杂交父本中黄16为对比品种, 比较了从花期至鼓粒中期HZ7009和对比品种的植株生物特点。从表2可以看出, 新品系HZ7009的单株鲜重和单株干物质重量均略低于中黄16, 而HZ7009植株的含水量和茎叶比均略高于中黄16, 两品种(系)在以上指标中均未达到差异显著水平。HZ7009的单株鲜重在结荚期、鼓粒初期和中期显著高于牡丹江秣食豆, 单株干物质重在鼓粒初期和中期显著高于牡丹江秣食豆。两个品种(系)的含水量在4个时期内无明显差异, HZ7009的茎叶比在鼓粒初期和中期显著低于牡丹江秣食豆。牡丹江秣食豆属于半野生大豆, 蔓生, 叶片小, 与栽培大豆HZ7009植株形态明显不同, 生物量差异较大。

表2 HZ7009的单株生物量比较 Table 2 Single plant biomass comparison of HZ7009

2.2.2 营养成分比较 HZ7009的干草饲用品质在不同时期的比较如表3所示, 从结荚期至鼓粒中期, 植株粗蛋白含量为HZ7009> 中黄16> 牡丹江秣食豆, 且HZ7009和牡丹江秣食豆的粗蛋白含量在结荚期和鼓粒中期存在显著差异, 与中黄16未达到差异显著水平。结荚期HZ7009的粗蛋白含量(22.23%)比牡丹江秣食豆的粗蛋白含量(18.31%)高出近4%。鼓粒中期HZ7009的粗蛋白含量(21.62%)比牡丹江秣食豆的粗蛋白含量(18.07%)高出3%。粗脂肪与粗蛋白的变化趋势相反, 鼓粒初期牡丹江秣食豆的粗脂肪最高, 与HZ7009达到差异显著水平, 而HZ7009随着生育期延长, 粗脂肪含量逐渐下降, 除结荚期, 从花期到鼓粒中期均低于牡丹江秣食豆的粗脂肪含量, 说明在鼓粒期粗脂肪含量高的牡丹江秣食豆的适口性比HZ7009好, 而在结荚期HZ7009的适口性比牡丹江秣食豆好, 但两者差异不明显。

表3 HZ7009的干草品质比较 Table 3 Hay quality comparison of HZ7009

粗纤维含量呈现先下降再升高的趋势, 鼓粒初期的各品种(系)粗纤维含量均较低, 且差异不显著。在结荚期, 粗纤维含量为HZ7009< 中黄16< 牡丹江秣食豆, 鼓粒中期HZ7009的粗纤维含量显著高于牡丹江秣食豆。牡丹江秣食豆的中性洗涤纤维含量从结荚期开始缓慢下降, 而HZ7009和中黄16的中性洗涤纤维含量从结荚期开始逐渐升高。在结荚期牡丹江秣食豆的中性洗涤纤维含量高于HZ7009, 而在鼓粒初期HZ7009的中性洗涤纤维含量高于牡丹江秣食豆, 但均未达到显著水平。HZ7009的酸性洗涤纤维含量在鼓粒中期显著高于牡丹江秣食豆, 在结荚期和鼓粒初期的酸性洗涤纤维含量均较低, 且未达到差异显著水平。刈割期拖后, 栽培大豆HZ7009的粗纤维含量、中性洗涤纤维含量增加明显, 不利于刈割后牲畜食用。牡丹江秣食豆的粗灰分含量呈下降趋势, HZ7009和中黄16的粗灰分含量下降后又升高, HZ7009和牡丹江秣食豆的粗灰分含量在鼓粒中期差异显著, 在结荚期HZ7009的粗灰分含量较牡丹江秣食豆低, 在鼓粒初期高于牡丹江秣食豆, 粗灰分含量为6%~7%。HZ7009在花期无氮浸出物为55.18%, 牡丹江秣食豆的无氮浸出物在鼓粒中期显著高于HZ7009, 说明HZ7009和牡丹江秣食豆分别在花期和鼓粒中期被动物消化和吸收的利用率较高。两者钙磷含量较为丰富, 且牡丹江秣食豆的钙含量较HZ7009高, 两者磷含量水平相当, 差异不显著, 各生育期内的钙磷比例均优于常用植物性蛋白饲料的钙磷比(0.33: 1~0.61: 1), 在结荚期的钙磷比例较其他生育期钙磷比高。

3 讨论

通过对胰蛋白酶抑制剂(Ti)缺失突变基因(ti)进行生化标记辅助选择育种, 我国已培育出中豆28[10]、中黄 16[11]、中黄 28以及大豆新品系中作962954、中作 9721121, 为大豆品质育种、生产及加工利用提供了优异种质资源。生化辅助选择育种实现了定向选育, 人工制种, 而且克服了预见性差、效率低的局限性, 该技术在许多物种中得到广泛应用[12, 13]。本研究以适宜在黄淮海地区栽培的胰蛋白酶抑制剂缺失大豆品种“ 中黄16” 为父本, 以适宜在黑龙江省种植的高产优质大豆品种“ 合丰50” 为母本, 利用常规杂交育种技术和分子育种技术相结合, 历时多年培育出适宜在黑龙江地区生长的Kunitz型胰蛋白抑制剂缺失的大豆新品系“ HZ8009” 。通过蛋白质组学明确了缺失胰蛋白酶抑制剂“ HZ8009” 中KTI3在大豆种子中表达量减少, KTI3与早期发现的Tia基因相对应[14], 确定了新品系“ HZ8009” 胰蛋白酶抑制剂的缺失类型[15]。新品系“ HZ8009” 可利用胰蛋白酶抑制剂缺失的特性作为籽粒用饲料豆粕, 也可根据其具有植株高大, 较晚熟和抗早衰等生长发育特点, 在适宜的刈割期利用植株作为干草饲草或青刈饲草利用。

提高粗蛋白质含量, 降低粗纤维含量是提高饲草营养价值、改善营养品质的重要内容。HZ7009在生育后期整株干物质中粗蛋白含量一般在18.52%~22.23%, 高于牡丹江秣食豆粗蛋白含量16.97%~18.66%, 及苜蓿(Lotus corniculatus)中粗蛋白含量为15%~22%[16], 更高于禾本科饲草, 青饲玉米(Zea mays)粗蛋白含量为6.24%~10.01%[17, 18], 及杂交狼尾草(Pennisetum alopecuroides)粗蛋白含量约为10%左右[19]。由于豆科牧草的营养价值、可利用营养成分和采食特征, 在单一豆科牧草或豆科牧草比重较大的禾草-豆科牧草混播草地上采食的不同种类、不同类型家畜的个体生产性能均优于在禾草草地上采食者[20, 21], 这充分利用了豆科牧草高蛋白的特点。优质饲草应当综合是否含有草食家畜所必需的各种营养物质和是否有较高的适口性与消化率这两方面来整体评定。饲草中NDF含量的高低反映饲草营养价值的高低及利用程度的高低, NDF含量越高, 饲草的营养价值越低, 饲草的适口性差, 被动物利用的程度也越低[21]。ADF含量的高低影响牲畜对饲草的消化率, ADF含量高, 饲草消化率低[22]。结荚期HZ7009的粗蛋白含量20.23%显著高于牡丹江秣食豆, 粗脂肪含量高于牡丹江秣食豆; 粗纤维、中性洗涤纤维、粗灰分含量低于牡丹江秣食豆。半野生型牡丹江秣食豆饲草在鼓粒期后更有利于营养物质的积累, 而Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失栽培大豆HZ7009则适宜在生殖生长前期作为饲草利用。通过品种比较, 初步明确了HZ7009的饲草用营养价值, 并且确定HZ7009的适宜刈割期为花期-结荚期, 宜早不宜晚。饲草品质的优劣, 通常根据干燥后饲草的营养成分含量和消化率来综合评定。但实际生产中, 常以收割时期成熟度、水分含量以及颜色和气味等外观特征来评定干草的饲用价值, 这些物理性质与适口性及营养物质含量有密切联系。HZ7009在生殖生长前期具备高蛋白、高生物量、低纤维素的特性, 可考虑籽粒鲜食用, 茎秆饲草用[23], 但在生殖生长后期可能面临着CF、NDF、ADF升高影响适口性和消化率等方面, 禾本科-豆科饲草混播可以解决类似问题[24], 且品质的改善和提高还可以通过不同品种类型[25]、不同施肥方式[26]、不同栽培措施等得以实现[27]。因此, 通过对其种植模式与栽培方式进行深入研究, 有利于发挥饲用大豆新品系“ HZ8009” 的优势, 更加有效合理地广泛利用。

4 结论

Kunitz型胰蛋白酶抑制剂缺失大豆新品系“ HZ8009” 生育期较长, 适宜在黑龙江省第一、二积温带种植。植株高大茎叶繁茂, 籽粒蛋白质含量42%, 脂肪含量20%。与专用豆科饲草作物品种牡丹江秣食豆相比, 干草产量提高21.39%, 干物质中粗蛋白质含量提高3.92%, 从单一饲草品质用途来看, 栽培大豆新品系“ HZ8009” 的饲用品质要好于半野生牡丹江秣食豆, 且通过比较各项干物质中品质含量明确了“ HZ8009” 最佳刈割时期为花期至结荚期, 该品系籽粒蛋白含量高, 且胰蛋白酶抑制剂缺失, 不仅浸提后豆粕饲用质量提高, 作为青刈饲草资源具有一定饲用价值, 可为豆科饲草资源储备品种加以利用。

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