试验材料:2018年6月初第一茬的初花期金皇后紫花苜蓿刈割于天津农学院试验田;

添加试剂:双乙酸钠(99%, 罗恩试剂)。

将刈割的新鲜苜蓿用铡刀将其铡短至1~2 cm, 试验设8个处理, 每个处理3个重复, 按照紫花苜蓿原料质量比分别为添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%双乙酸钠和对照组(CK), 将双乙酸钠添加入青贮原料并逐级混匀, 填充, 真空包装机抽真空烫压封口, 置于室内贮存45 d。

1.3.1 感观评定 青贮45 d后启封, 采用德国农业协会(deutsche landwirtschafts-gesellschaft, DLG)评分法, 根据青贮后饲料的气味、结构及色泽对青贮苜蓿进行评分, 依据得分分成优良、尚好、中等及腐败4个等级^[6]。

1.3.2 发酵品质指标测定 1)pH值的测定:取青贮料20 g于烧杯中, 加入180 mL去离子水, 搅拌混合均匀, 浸泡24 h后用4层纱布过滤, 再用双层滤纸过滤, 酸度计测定pH值^[12]; 2)采用纳氏试剂比色法^[13] 测定氨态氮(ammoniacal nitrogen, AN); 3)采用对羟基联苯比色法^[14] 测定乳酸 (lactic acid, LA); 4)采用气相色谱法^[15]测定挥发酸[乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)及丁酸(butyric acid, BA)]。

1.3.3 营养成分的测量 样品烘干粉碎用于以下营养成分的测定: 1)采用烘箱干燥法测定干物质(dry matter, DM); 2)采用高温灼烧法测定粗灰分(crude ash, Ash); 3)采用凯氏定氮法测定粗蛋白质(crude protein, CP); 4)采用索氏提取法测定粗脂肪(ether extract, EE); 5)采用范氏纤维法(VanSoest)测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF); 6)采用高锰酸钾法测定钙(calcium, Ca); 7)采用钼黄比色法测定磷(phosphorus, P)^[16]。

1.3.4 蛋白分子结构分析 图谱采集:样品烘干粉碎, 过0.25 mm分析筛, 启动Lambda ATR-FT/IR(天津港东科技有限公司), 设置扫描波长范围4000~800 nm, 扫描次数64次, 每个样品平行扫描10次^[17], 同时采集背景图谱以排除环境干扰。

蛋白分子结构图谱分析:采用图谱分析软件OMNIC 7.5依次对各个图谱进行分析, 将图谱纵坐标转化为吸光度, 对图谱进行自动基线校正、自动平滑处理, 之后做傅里叶去卷积, 以此来区分重叠谱图, 从而估计各个子峰的峰位^[18]。蛋白质的红外吸收光谱主要是由一系列酰胺模型的吸收区组成, 分析添加不同量双乙酸钠青贮苜蓿饲料中蛋白质结构的相关官能团, 从而进一步分析蛋白分子结构特征参数主要有酰胺Ⅰ 、Ⅱ 区的峰高及峰面积、酰胺Ⅰ 和Ⅱ 区的面积总和、面积比值及峰高比值、α -螺旋、β -折叠区的峰高、α -螺旋与β -折叠的比值。

采用 Excel 2010对原始数据进行整理, 采用 SPSS 20.0软件进行单因素方差分析, 用Duncan进行两两比较。P< 0.05 表明差异显著, 数据以“ 平均值± 标准差” 表示。

青贮苜蓿的感官评分(表1)结果表明, 对照组酸味稍重, 芳香味弱, 叶子结构保存较差, 呈淡黄色。而其他处理组感官良好, 无酸味, 有芳香味, 茎叶结构保持良好, 色泽与原材料相似, 呈淡绿色。添加双乙酸钠组的青贮苜蓿感官评定得分均大于对照组, 其中添加0.5%和0.6%组得分最高, 0.7%组的次之。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 双乙酸钠添加量对青贮苜蓿感官品质的影响 Table 1 The effect of sodium diacetate on sensory quality of alfalfa silage 处理组 Treatment 分值 Value 评分 Score 等级 Grade 气味 Smell 质地 Texture 色泽 Color 0 10 2 1 13 尚好 Fair 0.1% 12 4 2 18 良好 Good 0.2% 12 4 2 18 良好 Good 0.3% 12 2 1 15 尚好 Fair 0.4% 11 4 2 17 良好 Good 0.5% 14 4 2 20 良好 Good 0.6% 14 4 2 20 良好 Good 0.7% 12 4 2 18 良好 Good

表1 双乙酸钠添加量对青贮苜蓿感官品质的影响 Table 1 The effect of sodium diacetate on sensory quality of alfalfa silage

不同处理组青贮苜蓿的营养成分如表2所示, 与对照组相比, 仅添加0.4%双乙酸钠组干物质含量显著低于对照组(P< 0.05)。添加双乙酸钠的青贮苜蓿粗蛋白含量、粗灰分含量以及钙含量均大于对照组。粗蛋白含量随着双乙酸钠添加量增加而呈先升高后下降再上升的趋势, 其中添加0.3%~0.7%双乙酸钠粗蛋白含量显著高于对照组(P< 0.05), 添加0.3%~0.6%双乙酸钠的青贮饲料粗灰分和钙含量与对照组有显著差异(P< 0.05)。经双乙酸钠处理后, 青贮饲料中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及磷含量均有所降低, 其中经双乙酸钠处理的青贮苜蓿酸性洗涤纤维显著小于对照组(P< 0.05)。添加0.4%~0.7%双乙酸钠时, 中性洗涤纤维和磷含量与对照组差异显著(P< 0.05), 添加量为0.6%时, 中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量最低。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 双乙酸钠添加量对苜蓿青贮饲料营养品质的影响 Table 2 The effect of sodium diacetate on nutritional quality of alfalfa silage (DM %) 处理组 Treatment 干物质 Dry matter (DM) 粗蛋白 Crude protein (CP) 粗脂肪 Ether extract (EE) 粗灰分 Crude ash (Ash) 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (NDF) 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (ADF) 钙 Calcium (Ca) 磷 Phosphorus (P) 0 30.21± 0.58abc 13.99± 0.62b 4.40± 0.19c 8.03± 0.27e 55.93± 3.04a 41.11± 3.91a 1.02± 0.04c 0.73± 0.03a 0.1% 28.10± 2.06cd 14.16± 0.66b 2.78± 0.20d 10.85± 0.39b 51.71± 2.10ab 37.09± 1.66b 1.03± 0.06c 0.28± 0.03c 0.2% 30.85± 0.76ab 14.51± 0.22b 6.89± 0.41a 9.56± 0.40d 49.94± 2.87bc 37.71± 0.66b 1.12± 0.04bc 0.22± 0.00d 0.3% 29.83± 2.49abcd 15.89± 0.26a 6.79± 0.75a 10.30± 0.28c 49.97± 2.11bc 37.09± 1.37b 1.15± 0.13b 0.15± 0.00e 0.4% 27.52± 1.09d 16.17± 0.52a 5.66± 0.67b 11.46± 0.29a 46.32± 1.15c 34.82± 0.88b 1.36± 0.03a 0.15± 0.00e 0.5% 28.41± 0.36cd 16.27± 0.38a 6.83± 0.28a 10.64± 0.32bc 45.72± 1.00c 35.44± 0.40b 1.39± 0.04a 0.14± 0.01e 0.6% 28.57± 0.15bcd 15.77± 0.36a 6.93± 0.20a 10.62± 0.32bc 39.15± 0.61d 31.00± 1.09c 1.17± 0.09b 0.14± 0.00e 0.7% 31.20± 0.49a 16.40± 0.31a 7.30± 0.12a 8.41± 0.20e 47.11± 3.00bc 35.28± 0.88b 1.03± 0.04c 0.56± 0.02b 注:数据为平均值± 标准差, 同列不同小写字母表示差异显著(P< 0.05), 相同字母表示差异不显著。下同。 Note: The data are mean value± standard deviation, and the different letters indicates significant difference (P< 0.05), the same letters indicates that the difference is not significant. The same below.

表2 双乙酸钠添加量对苜蓿青贮饲料营养品质的影响 Table 2 The effect of sodium diacetate on nutritional quality of alfalfa silage (DM %)

青贮苜蓿发酵品质如表3, 经双乙酸钠处理的青贮苜蓿pH值均显著低于对照组(P< 0.05)。青贮苜蓿中乙酸含量均高于对照组, 其中添加量为0.2%和0.7%时差异显著(P< 0.05)。乳酸含量仅添加量为0.4%、0.6%和0.7%时高于对照组, 其中0.7%时与对照组达到显著水平(P< 0.05)。丙酸含量随着双乙酸钠添加量的增加而逐渐减少直至为0, 其中添加量为0.1%时与对照组差异不显著(P> 0.05), 其他处理组均显著低于对照组(P< 0.05)。经双乙酸钠处理丁酸含量均显著低于对照组(P< 0.05)。添加量较低的青贮苜蓿中氨态氮含量与对照组间差异不显著, 但随着添加量的增加差异逐渐显著(P< 0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 双乙酸钠添加量对青贮苜蓿发酵品质的影响 Table 3 The effect of sodium diacetate on fermentation quality of alfalfa silage 处理组 Treatment pH 乳酸 Lactic acid (LA, DM%) 乙酸 Acetic acid (AA, DM%) 丙酸 Propionic acid (PA, DM%) 丁酸 Butyric acid (BA, DM%) 氨态氮 Ammoniacal nitrogen (AN, DM%) 0 5.30± 0.10a 2.36± 0.00b 0.187± 0.000b 0.010± 0.000a 0.005± 0.000a 0.036± 0.000a 0.1% 2.98± 0.16d 1.24± 0.00e 0.219± 0.000b 0.009± 0.000a 0.002± 0.000bc 0.036± 0.003a 0.2% 3.47± 0.06c 1.62± 0.00d 0.419± 0.000a 0.004± 0.000b 0.001± 0.000cd 0.032± 0.001ab 0.3% 4.53± 0.42b 1.26± 0.00e 0.326± 0.000ab 0.004± 0.000bc 0.001± 0.000de 0.029± 0.001bc 0.4% 4.87± 0.14b 2.53± 0.00b 0.270± 0.000ab 0.003± 0.000bc 0.001± 0.000de 0.030± 0.001bc 0.5% 3.40± 0.18c 1.83± 0.00c 0.295± 0.000ab 0.002± 0.000c 0.002± 0.000b 0.027± 0.001c 0.6% 4.75± 0.10b 2.48± 0.00b 0.287± 0.000ab 0.002± 0.000c 0.001± 0.000de 0.028± 0.000bc 0.7% 2.62± 0.05d 3.10± 0.00a 0.411± 0.002a 0.000± 0.000d 0.000± 0.000e 0.026± 0.000c

表3 双乙酸钠添加量对青贮苜蓿发酵品质的影响 Table 3 The effect of sodium diacetate on fermentation quality of alfalfa silage

苜蓿原料、对照组和添加不同量双乙酸钠的青贮苜蓿中蛋白质分子酰胺Ⅰ 区基线范围是1710/1525 (表4), 对照组酰胺Ⅰ 区峰高及峰面积显著低于其他组(P< 0.05)。添加量为0.6%时, 酰胺Ⅰ 区峰高最高, 0.5%时酰胺Ⅰ 区峰面积最大。 酰胺Ⅱ 区基线范围为1562/1481, 酰胺Ⅱ 区对照组峰高和峰面积也均显著小于双乙酸钠各组(P< 0.05), 且各组间存在差异性, 部分达到了显著水平(P< 0.05)。添加双乙酸钠的青贮苜蓿酰胺Ⅰ 区与酰胺Ⅱ 区面积比和高度比均显著小于对照组(P< 0.05)。双乙酸钠添加量为0.2%时, α -螺旋区中心高度、β -折叠区中心高度最大, 而苜蓿原料的α -螺旋区中心高度、β -折叠区中心高度最小。苜蓿原料的α -螺旋区与β -折叠区中心高度比最小, 与其他组形成显著性差异(P< 0.05), 对照组的则显著低于双乙酸钠组(P< 0.05), 添加量为0.7%时比值最大, 0.6%次之。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同添加量的双乙酸钠苜蓿青贮蛋白质分子结构图谱特征 Table 4 Effects of different additions of sodium diacetate on molecular structure characteristic of alfalfa silage protein

表4 不同添加量的双乙酸钠苜蓿青贮蛋白质分子结构图谱特征 Table 4 Effects of different additions of sodium diacetate on molecular structure characteristic of alfalfa silage protein

本试验在青贮苜蓿中添加不同量的双乙酸钠, 从气味、质地和色泽3个方面对青贮苜蓿进行感官评定总体评分表明, 各组的感官评定均良好, 而对照组感官品质最差, 双乙酸钠各组评分均高于对照组, 且添加量为0.5%和0.6%时感官品质最佳。

本研究结果表明, 在苜蓿中添加双乙酸钠可改善青贮饲料的营养品质, 其中添加双乙酸钠青贮的苜蓿饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量都有一定程度的下降, 其中酸性洗涤纤维显著降低, 说明其可以提高饲料消化率; 蛋白含量均高于对照组, 表明饲料的营养成分不仅保存良好还得到了一定的改善。添加双乙酸钠与否对干物质地影响并不大, 差异性不显著。国卫杰等^[19]研究表明双乙酸钠的添加对裹包全混合日粮(total mixed rations, TMR)的感官和营养成分影响较小。青贮苜蓿的脂肪含量在添加双乙酸钠后稍有提高, 但添加0.1%时含量未得到提升; 对照组与处理组间相比钙含量也有所变化, 添加双乙酸钠后钙含量均有所升高但差异不显著(P> 0.05)。

青贮苜蓿除对照组, 其他处理组pH值均较低且丁酸、丙酸含量极少, 表明双乙酸钠可以抑制丁酸、丙酸生成。丁酸发酵程度是鉴定青贮饲料好坏的重要标志, 丁酸含量越低, 青贮饲料品质越好。乙酸含量均高于对照组, 可能与添加剂双乙酸钠的特性有关, 因为双乙酸钠是乙酸钠和乙酸的分子复合物。Oude Elferink等^[20]报道, 青贮接种布赫内布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)可以提高青贮物有氧稳定性, 其原因是发酵生成的乳酸转变为乙酸和1, 2-propanedial。另外, Kung等^{[ 21]}指出添加布赫内布氏乳杆菌后青贮物中含有乙酸浓度较高是提高青贮物有氧稳定性的根本原因。由此说明, 添加双乙酸钠可以提高青贮苜蓿饲料的有氧稳定性。氨态氮含量均显著降低, 且处于较低状态, 表明双乙酸钠对氨态氮的生成有良好的抑制作用。氨态氮是苜蓿青贮过程中蛋白质水解的产物, 氨态氮含量越高, 表明青贮过程中降解的蛋白质越多, 发酵品质越差, 而且会明显影响动物的采食量和饲料利用率^{[22, 23]}。添加适量双乙酸钠可降低青贮饲料的氨态氮含量, 说明双乙酸钠对青贮苜蓿的蛋白降解有抑制作用。这可能与双乙酸钠中乙酸钠具有吸湿干燥作用有关, 乙酸钠吸收了青贮原料部分渗出液, 破坏了苜蓿粗蛋白的水解环境, 降低了氨态氮的生成; 本试验研究表明, 发酵品质与双乙酸钠的分子态乙酸的抑菌作用有关, 分子态乙酸可以良好的抑制细菌及霉菌的生长与繁殖, 从而减少氨态氮的产生, 但该结论有待进一步进行研究探索。

常用粗蛋白含量判断饲料的营养价值, 但即使饲料粗蛋白含量相近, 蛋白质内部分子结构也不完全一致^[24]。为了进一步了解蛋白分子结构, 科研者不断研究, 发现可以通过蛋白质的红外光谱深入研究其结构。蛋白质的红外吸收光谱主要由一系列酰胺吸收带组成, 即酰胺Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ 、Ⅴ 、Ⅵ 、Ⅷ 、A和B带^[25]。蛋白质和多肽的二级结构存在于红外区的9个特征吸收带中, 其中酰胺Ⅰ 带 (Amide Ⅰ 1700~1600 cm^-1)最具有研究二级结构价值^[25]。酰胺Ⅰ 带各峰对应的二级结构的波数, α -螺旋1650~1658 cm^-1, β -折叠1610~1640 cm^-1, β -转角1660~1695 cm^-1, 无规则卷曲1640~1650 c m-1[18]。酰胺Ⅱ 带 (Amide Ⅱ 1600~1500 cm^-1)常用于蛋白质和多肽的构象研究^[26]。酰胺Ⅲ 带 (Amide Ⅲ , 1220~1330 cm^-1) 也可以用于多肽和蛋白质二级结构的分析^{[18, 27]}, 同时还解决了水分子的问题。蛋白质红外光谱酰胺Ⅰ 带的峰主要是由蛋白质骨架中的羰基振动引起的, 能够直观地反映蛋白质的构象及其变化^[28], 因此可以根据蛋白质二级结构含量变化来确定蛋白质变性情况。从蛋白分子方向分析, 青贮苜蓿中添加双乙酸钠可以显著提高酰胺Ⅰ 区、酰胺Ⅱ 区的峰高及峰面积、酰胺Ⅰ 区与Ⅱ 区面积总和、α -螺旋区与β -折叠区中心高度比, 表明添加双乙酸钠可以改变蛋白二级结构。饲料蛋白中α -螺旋和β -折叠比值不同, 说明其蛋白质的营养价值也不同^[17]。Yu^[29]研究指出, 蛋白质二级结构螺旋和折叠比值与饲料蛋白质的有效降解率有高度相关性。本试验结果表明, 对照组的α -螺旋区与β -折叠区中心高度比与双乙酸钠组相比发生了显著性变化, 表明苜蓿青贮后比青贮前被反刍动物消化降解的部分增多, 添加双乙酸钠的青贮苜蓿比不添加的易被动物消化降解。本研究表明, 酰胺Ⅰ 区主要由C=O肽链伸展振动、N-H 弯曲振动和少量的C-N伸展振动构成; 酰胺Ⅱ 区主要由N-H弯曲、C-N伸展和少量的C=O、C-C和N-C伸展组成^[30]。本试验结果表明, 酰胺Ⅰ 区峰高及峰面积苜蓿原料和对照组仅与部分组间的差异显著, 而酰胺Ⅱ 区苜蓿原料、对照组与其他组间差异均显著, 且酰胺Ⅰ 区与Ⅱ 区面积比和高度比也均与其他8组形成显著性差异(P< 0.05)。本试验结果表明, 苜蓿原料与青贮苜蓿的蛋白质分子结构存在差异, 对照组与双乙酸钠组的蛋白分子结构也存在差异, 不同之处主要在酰胺Ⅱ 区。影响因素包括饲料品质、压榨、转基因处理、发酵等加工方法, 蛋白质酰胺Ⅱ 区的差异会影响动物对蛋白质的利用和消化^[31]。

蛋白质分子光谱结构特性可能会影响蛋白质在瘤胃内的代谢特性。不同饲料种类、不同加工处理后瘤胃降解参数与蛋白质分子结构存在差异^[32]。本试验结果表明, 青贮处理与未青贮苜蓿以及添加双乙酸钠处理和无添加的青贮苜蓿可为动物提供相似的粗蛋白水平, 但由于二者酰胺Ⅱ 区显著不同, 蛋白质组分能够被动物吸收利用的程度可能也会有所差别, 有待于以后通过动物消化试验进一步验证。