引用本文
高丽敏, 苏晶, 田倩, 沈益新. 施氮对不同水分条件下紫花苜蓿氮素吸收及根系固氮酶活性的影响[J]. 草业学报, 2020, 29(3): 130-136。
GAO Li-min, SU Jing, TIAN Qian, SHEN Yi-xin. Effects of nitrogen application on nitrogen accumulation and root nitrogenase activity in Medicago sativa at different soil water contents [J]. Acta Prataculturae Sinica, 2020, 29(3): 130-136.  
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施氮对不同水分条件下紫花苜蓿氮素吸收及根系固氮酶活性的影响
高丽敏, 苏晶, 田倩, 沈益新*
南京农业大学草业学院,江苏 南京210095
*通信作者Corresponding author. E-mail: yxshen@njau.edu.cn

作者简介:高丽敏(1990-),女,山西临汾人,博士。E-mail: limingao@njau.edu.cn

收稿日期:2019-05-14 网络出版日期:2020-03-20
基金项目:科技部“十三五”国家重点研发计划(2017YFD0502106-1),国家自然科学基金青年科学基金项目(31802130)和中央高校基本科研业务费(KJQN201948)资助
摘要

氮肥施用可以调控不同水分条件下紫花苜蓿的生长,而其内在机制尚不明确。采用盆栽试验,通过设置3个水分梯度(田间最大持水量的30%、50%以及70%,分别用W1、W2、W3表示)及4个氮素水平(0、0.02、0.04、0.06 g·kg-1,分别用N1、N2、N3、N4表示),研究了不同水分条件下紫花苜蓿对氮素的需求规律及其与氮素吸收及根系固氮酶活性的关系。研究结果表明:1)W1水分条件下,氮肥施用可以显著提高紫花苜蓿生物量,而在W2及W3水分条件下,均以N3处理紫花苜蓿生物量最大;2)W1及W2水分条件下,N4处理植株氮素积累量最高,而在W3水分条件下,以N3处理氮素吸收量最高,植株氮素积累量与生物量间存在显著正相关关系;3)根系固氮酶活性随土壤水分有效性的增加而增加,随氮素供应量的增加而降低,在N4条件下,W4处理固氮酶活性与W3处理无显著性差异。因此,在低土壤水分条件下,氮素供应可以保证植株对氮素的需求并提高其生物量;在高土壤水分条件下,适宜供氮量可以促进紫花苜蓿的生长,但过高氮肥供应会显著抑制根系固氮酶活性并最终导致氮素吸收及生物量不再进一步增加。本研究结果可为紫花苜蓿生产系统中的水氮管理提供理论依据。

关键词: 紫花苜蓿; 氮肥施用; 土壤水分; 固氮酶活性; 氮素积累
Effects of nitrogen application on nitrogen accumulation and root nitrogenase activity in Medicago sativa at different soil water contents
GAO Li-min, SU Jing, TIAN Qian, SHEN Yi-xin*
College of Agro-Grassland Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract

The underlying mechanisms related to the impact of nitrogen fertilizer on alfalfa ( Medicago sativa) growth at different soil water contents remain unclear. A pot experiment with three soil water levels (30%, 50% and 70% of the field water-holding capacity; W1, W2 and W3), and four nitrogen application rates (0, 0.02, 0.04 and 0.06 g N·kg-1; N1, N2, N3 and N4) was conducted to study the utilization of nitrogen fertilizer by alfalfa under different soil water regimes, and the relationships with nitrogen accumulation and root nitrogenase activity. The results indicated that: 1) for W1, alfalfa biomass increased significantly with increase in nitrogen application rate, while for W2 and W3, the highest biomass values were observed in N3 treatment; 2) for W1 and W2, the highest nitrogen accumulation was obtained in the N4 treatment, while for W3, the N3 treatment had the highest nitrogen accumulation. A positive relationship between the amount of nitrogen applied and alfalfa biomass was therefore concluded; 3) the root nitrogenase activity was increased with increase in soil water availability, but decreased with increase in nitrogen rate. No significant difference in root nitrogenase activity was observed between W3 and W4 with N4 application. Therefore, it was concluded from these results that under lower soil water content, nitrogen application was essential for meeting nitrogen demand and would promote alfalfa growth, and under higher soil water content, moderate nitrogen fertilizer application was advantageous for alfalfa growth, while higher rates of nitrogen fertilizer application inhibited root nitrogenase activity, and therefore no significant differences in nitrogen accumulation and biomass were found. The results of the present study provide a theoretical basis for determining water and nitrogen management in alfalfa production systems.

Keyword: alfalfa; nitrogen application; soil water; nitrogenase activity; nitrogen accumulation

紫花苜蓿(Medicago sativa)作为重要的优良牧草在我国草牧业发展中的重要性日益凸现, 栽培面积不断增长[1]。紫花苜蓿喜温暖半干燥气候且对水分需求较大, 在干旱半干旱地区, 土壤水分因素成为限制其生长和种植推广的重要因素。同时, 紫花苜蓿生长期间又忌土壤积水。在我国南方一些地区, 土壤质地黏重, 年降水量较多, 地下水位偏高等因素成了限制紫花苜蓿推广种植的主要原因。氮素是植物生长所必需的大量元素之一, 在调控植物生长以及品质形成方面起着举足轻重的作用[2]。土壤中的氮素以质流方式到达根表并进入根系后, 一部分在根系内直接被同化利用, 另一部分在中柱细胞经蒸腾流被运输至地上部进一步同化。因此, 水分有效性通过影响质流强度以及蒸腾速率影响植株氮素有效性[3]。研究认为, 当土壤湿度低于15%时, 氮肥施用对甜菜(Beta vulgaris)生长无显著影响; 随土壤含水量的增加, 植株对氮素的吸收能力增加, 且在土壤湿度为25%时达到最大[4]。同时, 土壤中氮素含量及形态的改变会通过调控根系形态、解剖结构、水通道蛋白的活性或表达, 以及地上部蒸腾等影响水分的吸收利用率。可见, 合理的水氮供应会通过影响氮素及水分吸收调控植物的生长[5, 6]。

关于紫花苜蓿在种植过程中是否需要氮肥投入及氮肥应投入多少这一关键问题上, 目前仍存在较大的争论。有一部分观点认为紫花苜蓿作为豆科牧草能与根瘤菌共生, 可以通过固定空气中的氮素以满足自身需要, 因此氮肥的施用对紫花苜蓿生长的影响较小, 相反, 氮肥的施入会导致杂草的快速生长, 降低紫花苜蓿在生态系统中的竞争力; 也有一部分研究认为紫花苜蓿在生长前期及衰老期, 由于根瘤菌固氮酶活性相对较弱, 氮肥的施用可以显著促进紫花苜蓿的生长[7]。由此可见, 根系固氮酶活性是决定紫花苜蓿对氮肥需求的主要影响因子。随着紫花苜蓿在全国范围内推广种植, 研究不同土壤含水量条件下紫花苜蓿的氮素需求这一问题成为当前紫花苜蓿生产中亟待解决的首要问题。然而, 目前仅有的一些关于氮素及水分供应对紫花苜蓿生长的研究中, 大多都忽略了根系固氮酶活性在此过程中的作用。因此, 本研究着眼于紫花苜蓿在不同水分条件下氮肥施用对植株氮素积累以及根系固氮酶活性的影响, 以期为紫花苜蓿生产系统中的水氮管理提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料

试验采用在长江中下游农区推广种植的高产紫花苜蓿品种“ 赛迪7号” 为供试品种。供试土壤基本理化性状为:土壤有机质为28.3 g· kg-1、全氮0.294 g· kg-1、速效氮15.8 mg· kg-1、速效磷38.6 mg· kg-1、速效钾85 mg· kg-1、pH 6.5。供试肥料分别为:氮肥为尿素(总氮≥ 46.4%); 磷肥为过磷酸钙(含P2O5 15%); 钾肥为氯化钾(含K2O 62%)。

1.2 试验设计

试验于2018年4-6月在南京农业大学牌楼试验基地进行。试验采用随机区组设计, 设氮肥供应量、土壤水分含量两个因素, 氮肥供应量设4个水平, 分别为:每kg干土施纯氮(N)量(速效氮)折合为:0、0.02、0.04、0.06 g· kg-1(分别用N1、N2、N3、N4表示); 土壤水分含量设3个水平, 分别为:田间最大持水量(24%)的30%(干旱)、50%(正常水分)以及70%(水分充足且未渍水)(分别用W1、W2、W3表示), 每日称重并加水以维持相应的土壤含水量。试验共9个处理组合, 每个处理设置6个重复, 共54盆。磷、钾肥用量分别为0.16与0.03 g· kg-1, 所有肥料在装盆时一次性施入。

盆栽试验采用直径为22 cm× 30 cm聚乙烯盆钵种植, 每盆装干土5 kg。装盆前, 将5 kg干土与氮磷钾肥充分混合均匀后装盆。装土过程中保证土壤松紧合适。选取大小一致且饱满的种子播种, 每盆播50粒, 第一片真叶出现时定苗25棵并每盆接种25 mL苜蓿根瘤菌液(菌种为中华根瘤菌RM1021), 待第二片真叶出现时进行水分处理。试验期间进行正常浇水管理和病虫害防治。处理50 d后进行各项指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 样品采集 各随机选取4盆, 每盆选取10株并齐地刈割(留茬高度为0 cm), 分离根、茎和叶并带回实验室, 将各部分用蒸馏水洗净后, 于105 ℃烘箱内杀青30 min, 之后75 ℃烘干至恒重, 称重后记录每部分生物量并计算每株平均干重。

1.3.2 植株氮含量的测定 将各部分植株样品烘干粉碎后, 准确称取0.05 g 置于消煮管中, 采用H2SO4-H2O2法[8]于260~270 ℃高温消化, 定容后用流动分析仪(BRAN+LuEBBE, 德国)测定消化液中的氮素含量, 计算植株各组织氮浓度。植株氮素积累量采用如下公式计算:

氮素积累量=生物量× 氮浓度

1.3.3 根系固氮酶活性的测定 将根瘤洗净并擦干后, 装入棕色广口瓶中并盖上预先打好孔的胶塞, 打孔处连接玻璃导管及胶皮导管, 采用夹子夹住使之形成封闭系统。采用注射器抽出50 mL空气, 并从储气袋中精确抽取50 mL乙炔打入广口瓶中。28 ℃保温1 h后, 取出混合气体并用气相色谱仪(安捷伦7890, 美国)测定乙烯峰面积, 固氮酶活性用每g根瘤于每小时产生的乙烯量(nmol)表示。

1.4 数据处理分析

运用SPSS 16.0及Microsoft Excel 2010进行方差分析, 并采用LSD多重比较进行显著性分析。

2 结果与分析
2.1 不同处理对紫花苜蓿生物量的影响

由表1可知, 氮肥处理可以显著提高紫花苜蓿叶片、茎秆以及根系的生物量。在干旱(W1)条件下, 紫花苜蓿总生物量随氮肥用量的增加而增加, 而在正常水分(W2)及充足水分(W3)条件下, 随氮肥用量的增加, 紫花苜蓿总生物量呈现先增加后降低的趋势:与不施肥对照(N1)相比, 在W1、W2及W3条件下, 氮肥处理使得紫花苜蓿总生物量分别提高了20%~61%、24%~33%以及11%~19%。其中, W1条件下以N4处理增加效果最为显著(61%); 而在W2及W3条件下, 以N3处理效果最为显著(分别为27%及 19%)。与W2N3及W3N3处理相比, W2N4及W3N4处理中, 紫花苜蓿总生物量分别降低了0.8%及7.2%。

表1 水氮处理对紫花苜蓿生物量的影响 Table 1 Effects of nitrogen fertilizer and soil water content on alfalfa biomass

土壤水分有效性的提高显著促进了紫花苜蓿生物量的增加, 随土壤水分含量的增加, 紫花苜蓿生物量持续增加:与W1处理相比, W2及W3条件下, 紫花苜蓿总生物量分别增加了43%~48%及28%~86%。水分处理对N1及N2条件下紫花苜蓿生长的促进作用显著高于N3及N4条件下(表1)。

2.2 不同处理对不同部位氮素含量及植株氮素积累量的影响

氮肥施用对不同水分条件下茎秆氮含量的影响较小, 各处理间无显著性差异; 叶片及根系氮素含量随施氮量的增加而增加:与不施肥处理相比, 在不同水分条件下, 氮肥施用使得叶片氮素含量分别增加了8%~29%(W1)、11%~34%(W2)及8%~23%(W3), 根系氮素含量分别增加了10%~45%(W1)、8%~28%(W2)及1%~10%(W3)(表2)。

表2 水氮处理对紫花苜蓿根、茎、叶氮含量的影响 Table 2 Effects of nitrogen fertilizer and soil water content on nitrogen content in root, stem and leaf of alfalfa

如表2所示, 同一氮素水平中, W2水分条件下紫花苜蓿茎秆氮素含量达到最大; 就叶片氮素含量而言, 随水分含量的增加呈现先增加后降低的趋势, 在不同氮供应量条件下, 叶片氮素含量均在W2处理中最大; 就根系氮素含量而言, 在N1及N2处理中, W3水分处理显著提高根系氮素含量, 而在N3及N4处理中, 以W1处理根系氮含量最高。

随着氮素供应量的增加, 茎秆及叶片中氮素积累量逐渐增加; 就根系而言, 在W2处理中, 以N3处理下根系氮素积累量达到最大。最终, 除W3N4处理外, 其余处理植株氮素总积累量均呈现随氮素供应量增加而增加的趋势。与不施肥处理相比, 在W1、W2、W3处理中, 施肥使得植株总氮素积累量分别提高了30%~104%、45%~79%以及15%~28%。此外, 在同一氮素供应条件下, 除W3N4处理外, 其余处理植株氮素积累量均随土壤水分含量的增加而增加(表3)。通过相关性分析发现(图1), 不同水分条件下, 紫花苜蓿生物量与植株氮素积累量间均存在显著正相关关系(P< 0.05)。

表3 水氮处理对紫花苜蓿根、茎、叶及植株氮素积累量的影响 Table 3 Effects of nitrogen fertilizer and soil water content on nitrogen accumulation in root, stem, leaf and the whole plant of alfalfa

图1 紫花苜蓿氮素积累量与生物量间的相关关系Fig.1 The relationship between nitrogen accumulation and biomass of alfalfa

2.3 不同处理对根系固氮酶活性的影响

如图2所示, 随土壤水分含量的增加, 紫花苜蓿根系固氮酶活性显著增加, 与W1处理相比, W2及W3条件下, 根系固氮酶活性分别增加了23%~46%及33%~56%; 随氮素供应量的增加, 紫花苜蓿根系固氮酶活性显著降低, 在W1、W2、W3条件下, 与N1处理相比, 施氮导致根系固氮酶活性分别降低了18%~48%、13%~38%及11%~39%。

图2 水氮处理对紫花苜蓿根系固氮酶活性的影响
不同字母表示LSD检验5%水平差异显著。Fig.2 Effect of soil water content on the nitrogen fixation activity under different nitrogen supply amount in alfalfa root
Different letters indicate significant difference at 5% level by LSD test.

3 讨论

水分是影响紫花苜蓿生长发育以及产量的重要因素。研究认为在干旱条件下, 紫花苜蓿株高、分枝数、叶片生物量及产量均受到显著抑制[9, 10], 而灌溉可以显著提高紫花苜蓿干草产量[11, 12]。然而, 过高的土壤含水量会显著抑制紫花苜蓿主根的伸长生长以及主根直径进而影响其株高以及生物量[13]。作为植物生长所必需的大量元素之一, 氮肥的合理施用可以通过调控不同水分条件下紫花苜蓿的根系发育、水分利用率以及光合速率等过程影响其生长及产量[7, 13, 14, 15, 16], 而目前对于氮肥及水分管理对紫花苜蓿氮素吸收及根系固氮酶活性的研究较少。本研究发现, 土壤水分有效性的提高可以显著促进紫花苜蓿的生长, 而在不同水分条件下, 紫花苜蓿对氮肥的需求量不同:在土壤水分含量较低时(W1), 氮肥施用可以显著并持续地提高紫花苜蓿生物量; 而当土壤水分含量适中(W2)及充足(W3)时, 较高的氮素水平(N3)即可保证紫花苜蓿达到最大生物量, 而后氮肥施用对紫花苜蓿生物量的提高效果不明显(表1)。这说明通过适当的氮肥管理调控不同水分条件下紫花苜蓿的生长是可行的。鉴于植株氮素在调控植物生长发育过程中的重要性, 本研究进一步分析了水分及氮素对紫花苜蓿植株氮素浓度及积累量的影响。研究结果表明, 氮素施用均能促进紫花苜蓿根、茎、叶中的氮素含量(表2), 这与前人研究结果一致[17]。大量研究表明, 叶片氮素含量与叶片光合速率间存在极显著正相关关系[15, 18], 因此, 氮素施用对紫花苜蓿生长的作用与叶片氮素含量增加导致的光合速率增加有关。此外, 有研究表明, 在豆科植物生长前期, 适宜的氮素含量对根系有效结瘤的形成具有重要的意义[19], 因此, 氮素供应对不同水分条件下紫花苜蓿的生长可能与根系氮素含量有关。进一步研究表明, 植株氮素积累量与生物量间存在显著正相关关系(图1)。由此说明, 不同水分条件下氮素施用通过影响紫花苜蓿对氮素的吸收进而调控了其生长。

根瘤菌的固氮酶活性决定了紫花苜蓿的生物固氮能力及植株体内的氮素含量。本研究发现, 根系固氮酶的活性随土壤水分有效性的提高显著增加, 而氮肥的施用则显著抑制了根系根瘤菌的固氮酶活性(图2)。前人研究表明, 在土壤失水的情况下, 地上部碳同化过程以及碳水化合物向根系的运输均受到抑制, 同时根瘤菌对寄主植物的识别及侵染、根瘤菌的运动均会受到影响, 最终抑制根瘤菌的生长和活性[20, 21]。因此在本研究中, 随着土壤水分含量的增加, 根系固氮酶活性的增加可能是由根瘤菌对寄主的识别及其运动的增加导致的, 且根系生物量的增加为根瘤菌生长及活性的提高提供了必要的碳水化合物, 最终导致固氮酶活性的提高(图2)。而在高氮且水分充足条件下(W3N4), 尽管水分有效性的增加显著提高了固氮酶的活性, 且氮素供应量的增加使得根系碳水化合物的含量有所增加, 但是氮素对固氮酶活性的抑制作用大于对其活性的提高, 最终导致其活性与W3N3相比无显著性差异, 这可能是由于与直接吸收土壤中无机氮相比, 根系固氮过程将消耗更多的能量[22, 23]。前人研究结果也已证实氮肥的大量施用会抑制根瘤菌的定植、固氮酶的活性以及根瘤菌分化与生长[24, 25]。由此可见, 在较低土壤水分条件下, 根系固氮酶活性较低, 氮素供应保证了紫花苜蓿生长所需的氮素, 从而提高了其对氮素的吸收进而促进生长; 而在水分充足条件下(W3), 固氮酶活性有所提高, 同时过高的氮肥供应又会显著抑制根系固氮酶活性(N4W2与N4W3处理间无显著差异), 从而使得氮肥供应对植株氮素吸收及生长的促进影响较小。

4 结论

土壤水分含量的提高能促进紫花苜蓿的生长及对氮素的吸收。在低土壤水分条件下, 根系固氮酶活性较低, 氮素供应可以保证植株对氮素的需求进而提高其生物量; 在高土壤水分条件下, 根系固氮酶活性提高, 适宜供氮量可以促进紫花苜蓿的生长, 而过高氮肥供应会显著抑制根系固氮酶活性, 最终导致其氮素吸收及生物量不再进一步增加。因此, 在土壤缺水的地区或季节种植紫花苜蓿, 氮肥施用可以显著提高产量; 而在土壤水分含量较为充足的地区, 需确定适宜的施氮量, 过量施用氮肥不仅提高种植成本, 而且存在降低产量的风险。

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