本试验以2018年内蒙古包头市九原区哈林格尔镇包头市鑫泰农业科技有限公司种植基地种植的第2茬紫花苜蓿为原料, 品种为WL232HQ, 其特性见表1。甲酸添加剂购自河北化学试剂公司。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 原料特性 Table 1 Pre-ensiled characteristics 干物质 Dry matter (%) 粗蛋白 Crude protein (%DM) 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (%DM) 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (%DM) 32.41 23.91 42.06 36.52

表1 原料特性 Table 1 Pre-ensiled characteristics

采用双因素试验设计, 一因素为青贮时间, 含3水平, 分别为30、60和120 d; 另一因素为甲酸添加剂, 含4水平, 其中, 添加剂量为0作为对照组(CK), 其余3个水平分别为3(A₁)、6(A₂)和9 mL· kg^-1(A₃)。将初花期(10%植株开花)的紫花苜蓿刈割后就地进行晾晒至含水量为55%~60%, 切碎至2~3 cm, 将切碎的苜蓿与甲酸添加剂充分混匀后装入青贮袋中, 共12个处理, 每个处理3个重复, 分别按照不同的青贮时间开袋, 分析其发酵品质和营养成分。

青贮开袋时, 称取10 g青贮饲料, 加90 mL蒸馏水, 充分搅拌均匀, 放在拍打式无菌均质器(JX-0.5, 上海)中拍打1 min, 拍打后用4层纱布和中速定性滤纸进行过滤, 将滤液置于-20 ℃冰箱中保存, 用于测定发酵指标; 采用HANNA pH 211型精密pH计测定浸提液的pH值^[21]; 采用苯酚次氯酸钠比色法测定氨态氮(NH₃-N)含量^[22]; 采用Prominence高效液相色谱仪测定有机酸的含量(乳酸、乙酸、丙酸及丁酸)^[23], 流动相:3 mmol· L^-1高氯酸, 流速:1 mL· min^-1, 柱温50 ℃, 检测波长210 nm, 进样量5 mL^[7]。从剩余青贮饲料中称取120 g左右在105 ℃条件下烘20 min, 然后65 ℃恒温烘48 h至恒重, 烘干样品粉碎过筛(0.42 mm)后放入自封袋中密封保存, 用于测定营养成分; 采用烘干恒重法测定干物质(dry matter, DM)含量^[24]; 采用凯式定氮法测定粗蛋白(crude protein, CP)和总氮(total nitrogen, TN)含量^[24]; 采用范式纤维法测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量^[24]; 采用蒽酮-硫酸法测定可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)含量^[24]; 采用索式脂肪提取法测定粗脂肪(ether extract, EE)含量^[24]。

采用Excel 2010对数据进行初步整理, 以SPSS 22.0软件进行双因素方差分析, 结合Duncan法进行多重比较(P< 0.05), 数据以“ 平均值± 标准差” 表示。

由表2可知, 甲酸添加剂对紫花苜蓿青贮乳酸、氨态氮/总氮及pH值的影响达到了显著水平(P< 0.05), 对其他发酵指标无显著影响(P> 0.05)。青贮时间和添加剂的交互效应对各发酵指标均无显著影响(P> 0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 甲酸添加剂和青贮时间的方差分析 Table 2 Variance analysis of the interaction of ensiling time and formic acid additive 项目Item P值 P value 甲酸添加剂 Formic acid additive 青贮时间 Ensiling time 甲酸添加剂与青贮时间的交互效应The interaction effect of ensiling time and formic acid additive 乳酸Lactic acid < 0.05 < 0.05 0.74 乙酸Acetic acid 0.71 0.80 0.95 丙酸Propionic acid 0.84 0.77 0.83 丁酸Butyric acid - - - pH < 0.05 0.92 0.76 氨态氮/总氮NH3-N/TN < 0.05 < 0.05 0.63 干物质Dry matter < 0.05 < 0.05 < 0.05 粗蛋白Crude protein < 0.05 0.42 0.06 中性洗涤纤维Neutral detergent fiber < 0.05 < 0.05 < 0.05 酸性洗涤纤维Acid detergent fiber < 0.05 < 0.05 0.10 可溶性碳水化合物Water soluble carbohydrate 0.14 < 0.05 0.29 粗脂肪Ether extract < 0.05 < 0.05 < 0.05

表2 甲酸添加剂和青贮时间的方差分析 Table 2 Variance analysis of the interaction of ensiling time and formic acid additive

由表3可知, 青贮30 d, A₃乳酸含量最高, 为6.59%, CK最低, 为1.87%。随着青贮时间的增长, 到120 d, 各处理乳酸含量变化不一样, 以A₁最稳定, A₃变化幅度最明显。除CK外, 各浓度下乳酸含量均以青贮30 d为最大; 各青贮时间下, 乳酸含量均以A₁为最小。随着青贮时间的增长, 乙酸和丙酸含量变化稳定, 甲酸添加剂及青贮时间对乙酸及丙酸含量无显著作用(P> 0.05)。丁酸含量只有在青贮120 d, CK和A₃组中检测出。不同处理组pH值与CK差异显著(P< 0.05)。除A₁外, 氨态氮/总氮随添加剂及青贮时间显著变化。青贮30、60和120 d, CK氨态氮/总氮均高于处理组, 与A₂和A₃差异显著(P< 0.05)。除A₃外, 以青贮120 d苜蓿氨态氮/总氮值最高, 其中, CK和A₁氨态氮/总氮随着青贮时间的减少而降低。A₃中, 青贮60 d氨态氮/总氮最高, 为7.87%, 较120和30 d高了0.55%和0.84%。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 甲酸添加剂及青贮时间对苜蓿发酵品质的影响 Table 3 Effects of ensiling time and formic acid additive on fermentation quality of alfalfa 青贮时间 Ensiling time (d) 甲酸添加剂 Formic acid additive pH 乳酸 Lactic acid (%DM) 乙酸 Acetic acid (%DM) 丙酸 Propionic acid (%DM) 丁酸 Butyric acid (%DM) 氨态氮/总氮 NH3-N/TN 30 CK 5.65± 0.44a 1.87± 0.02e 1.36± 0.08a 0.11± 0.01a - 8.25± 0.17ab A1 4.88± 0.04b 2.87± 0.02d 1.40± 0.09a 0.20± 0.02a - 8.13± 0.36ab A2 4.02± 0.08c 5.28± 0.07b 1.49± 0.02a 0.07± 0.02a - 6.45± 0.64de A3 4.94± 0.03b 6.59± 0.04a 1.41± 0.06a 0.17± 0.02a - 7.03± 0.27cd 60 CK 5.54± 0.01a 1.53± 0.06e 1.25± 0.05a 0.08± 0.01a - 8.35± 0.09ab A1 4.74± 0.02b 2.50± 0.02d 1.28± 0.03a 0.03± 0.01a - 8.27± 1.22ab A2 4.00± 0.01c 4.11± 0.07c 1.39± 0.04a 0.04± 0.01a - 5.74± 0.26e A3 4.85± 0.03b 4.29± 0.07c 1.43± 0.04a 0.05± 0.02a - 7.87± 0.59abc 120 CK 5.87± 0.17a 2.25± 0.02d 1.33± 0.02a 0.05± 0.04a 0.07± 0.01a 8.75± 0.12a A1 4.84± 0.17b 1.57± 0.01e 1.34± 0.02a 0.03± 0.01a - 8.50± 0.13a A2 4.00± 0.07c 1.87± 0.03e 1.38± 0.02a 0.05± 0.01a - 6.90± 0.41cd A3 4.81± 0.01b 2.25± 0.05d 1.21± 0.02a 0.05± 0.02a 0.09± 0.01a 7.32± 1.13bcd 注:同列不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。下同。 Note: Different small letters show significant differences at the P< 0.05 level. The same below.

表3 甲酸添加剂及青贮时间对苜蓿发酵品质的影响 Table 3 Effects of ensiling time and formic acid additive on fermentation quality of alfalfa

从表2可知, 甲酸添加剂和青贮时间的交互作用显著影响着DM、NDF和EE含量(P< 0.05), 但对CP、ADF和WSC含量无显著影响(P> 0.05)。青贮60 d时, 苜蓿拥有较高的DM含量, 最高为A₃处理, 为27.36%(表4)。青贮30和60 d, DM含量从高到低依次均为A₃> A₂> CK> A₁; 青贮120 d, DM含量从高到低依次为A₃> CK> A₂> A₁。青贮料CP以青贮30 d, A₂处理最高, 与青贮60和120 d A₂处理差异不显著(P> 0.05); 青贮30、60和120 d时, 均以A₂处理CP含量最高, 分别达22.81%、22.20%和22.32%, 与CK、A₁和A₃差异显著(P< 0.05)。青贮30 d时, A₁处理NDF值最高, 为45.28%, 显著高于CK、A₂和A₃(P< 0.05), 分别高了4.45%、8.51%和2.99%; 随着青贮时间的增加NDF含量呈先下降后上升的趋势(A₁和A₃处理), A₂处理及CK变化不稳定。青贮60 d时, CK的NDF最高, 为42.30%, 与A₁和A₂处理差异显著(P< 0.05); 青贮120 d时, NDF值最高为A₂处理, 达43.68%, 但与A₁、A₂处理及CK差异均不显著(P> 0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 甲酸添加剂及青贮时间对苜蓿营养品质的影响 Table 4 Effects of ensiling time and formic acid additive on nutritional quality of alfalfa 青贮时间 Ensiling time (d) 甲酸添加剂 Formic acid additive 干物质 Dry matter (%) 粗蛋白 Crude protein (%DM) 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (%DM) 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (%DM) 可溶性碳水化合物 Water soluble carbohydrate (%DM) 粗脂肪 Ether extract (%DM) 30 CK 22.51± 0.15bc 19.82± 0.45bc 40.83± 2.53bc 39.13± 4.86a 5.19± 0.15c 2.83± 0.17cd A1 21.25± 0.03c 19.86± 0.71bc 45.28± 3.92a 28.66± 2.26bc 4.71± 0.73cd 2.16± 0.37d A2 24.58± 0.04b 22.81± 0.61a 36.77± 4.13d 26.57± 2.20c 4.73± 0.34cd 4.47± 0.64a A3 26.35± 0.05a 18.55± 1.39c 42.29± 9.58ab 26.56± 2.79c 4.81± 0.85c 3.61± 0.28b 60 CK 24.14± 0.06b 19.69± 0.59bc 42.30± 2.22ab 38.46± 6.22a 4.98± 0.25c 3.09± 0.10c A1 22.55± 0.03bc 20.83± 1.01b 36.26± 2.89d 27.30± 2.98bc 4.50± 0.41d 4.21± 1.23a A2 27.09± 0.05a 22.20± 1.11a 38.12± 0.55c 25.78± 3.83c 4.89± 0.08c 3.55± 0.26b A3 27.36± 0.05a 18.99± 0.10c 40.10± 3.97bc 27.71± 2.82bc 4.52± 0.05d 2.42± 0.59d 120 CK 24.27± 0.01b 19.64± 0.50bc 41.12± 2.72bc 38.95± 5.03a 6.26± 0.17b 2.70± 0.12cd A1 20.44± 0.03c 19.89± 0.96bc 42.33± 1.81ab 32.74± 0.49b 7.33± 1.23a 2.37± 0.13d A2 21.28± 0.01c 22.32± 1.12a 43.68± 4.75ab 30.94± 0.74b 6.79± 0.53ab 2.60± 0.41cd A3 25.40± 0.01ab 18.27± 0.57c 42.91± 2.08ab 31.85± 1.17b 4.46± 0.22d 2.56± 1.13cd

表4 甲酸添加剂及青贮时间对苜蓿营养品质的影响 Table 4 Effects of ensiling time and formic acid additive on nutritional quality of alfalfa

甲酸添加剂和青贮时间显著影响了青贮过程中原料ADF含量(表2和表4)。与CK相比, 不同浓度甲酸添加剂处理后苜蓿青贮的ADF含量均有所降低。除A₃处理外, 随着青贮时间的增加, ADF含量呈先降低再增高趋势, 青贮60和120 d均以A₂处理ADF值最低。甲酸添加剂对青贮过程中苜蓿WSC含量变化无显著作用(P> 0.05), 除A₃外, 其他处理及CK组 WSC含量均以青贮120 d最高, 各处理下, 以青贮120 d的A₁处理最高, 为7.33%, 较A₃处理高了2.87%。表4所示, 苜蓿EE含量以青贮30 d的A₂处理最高, 为4.47%, A₁处理最低, 为2.16%; 青贮60 d, A₁最高(4.21%), 显著高于A₂和A₃处理(P< 0.05); 青贮120 d时, 各处理与CK组EE含量变化不明显, 但以CK最高(2.70%), 分别较A₁、A₂和A₃处理高了0.33%、0.10%和0.14%。

调制苜蓿青贮时, WSC含量低易导致青贮过程中原料的腐败, 因此常采用添加甲酸添加剂来保证青贮过程中原料的品质, 起到防腐剂的作用, 抑制有害微生物的滋生。本试验中A₁、A₂和A₃处理组pH值显著低于CK组, 其中, A₂处理pH值最低, 效果最好, 表明甲酸添加剂能够有效降低青贮过程中的pH值, 这与王莹等^[8]和Nagel等^[25]研究结果一致。钟敏等^[26]研究表明, 紫花苜蓿青贮时, 加入纯度为42%的甲酸原液, 可显著提高乳酸含量, 降低乙酸、丙酸、氨态氮含量, 不产生任何丁酸。本试验中, 除青贮120 d外, 添加不同浓度甲酸添加剂均显著提高苜蓿乳酸含量(乳酸含量以A₂和A₃处理较高), 降低了丁酸和丙酸含量(A₁、A₂处理较低), 同时也降低了氨态氮含量(A₂处理最低), 这与钟敏等^[26]研究相一致。徐炜等^[27]的试验也得出类似结果。

青贮时间也是影响苜蓿青贮过程中的一个重要环节, 有研究表明, 随着青贮时间的降低, 乳酸发酵越有效, 青贮品质越好, 饲料稳定性也高^[28]。本试验中, 青贮时间影响着乳酸含量和氨态氮/总氮值, A₁和A₂处理时, 随着青贮时间的增长, 乳酸含量呈减少趋势。除A₂处理外, 氨态氮/总氮值以青贮120 d最高, 这与乳酸含量变化受青贮时间和温度影响这一研究结论一致^[28]。

本研究中甲酸添加剂和青贮时间之间的交互作用对苜蓿青贮发酵品质无显著影响。这是因为甲酸添加剂是影响苜蓿青贮料发酵品质的主要因素而青贮时间未对乙酸、丙酸、丁酸及pH值等指标造成影响。

在青贮过程中, 由于植物的呼吸、微生物的蛋白酶活动及微生物的脱氨作用等均会对青贮的保存产生不良影响, 同时也会造成原料营养成分的流失, 因此在青贮过程中原料成分也随之发生变化^[29]。本试验中, 甲酸添加剂浓度为6 mL· kg^-1(A₂处理), CP含量最高, DM、WSC含量也较好, ADF和NDF含量较低(表4), 表明6 mL· kg^-1为较适宜的甲酸添加浓度, 且EE含量较CK高, 这与Phillp^[30]、Nagel等^[25]的研究结果一致, 但与徐炜等^[27]、韩立英等^[31]研究结论相反, 表明适宜剂量的甲酸添加剂能够保证青贮过程中原料的营养品质, 同时抑制因微生物等作用造成的营养成分的流失。A₁、A₂处理CP含量高于CK, 但A₃处理却低于CK, 这可能是A₃处理添加剂量较大, A₁、A₂剂量较适宜。NDF和ADF是反映植物纤维质量的最直接指标, 同时也是反映反刍动物消化率及饲用价值的有效指标^[27]。本研究中, 与CK相比, A₁、A₂和A₃处理显著降低了原料ADF值, 但NDF值、WSC含量变化无规律, 表明只有适量浓度的甲酸添加剂才能够保证苜蓿的品质, 添加过量和少量的甲酸添加剂都不能保证。因此, 若以甲酸作为苜蓿青贮发酵过程中的添加剂, 建议选择6 mL· kg^-1的添加剂量, 才能够保证植物的纤维质量, 促进反刍动物对苜蓿青贮料的消化利用。

有研究表明, 青贮时间是影响苜蓿青贮过程中营养品质好坏的重要因素^[32]。本研究中, 除CP外, 其他营养成分均受青贮时间的影响。其中, 各浓度下, DM和CP含量以青贮60 d最高, ADF含量最低, 而WSC含量也较高, NDF值也较低, 表明60 d是青贮时间中适宜的选择。

青贮时间和甲酸添加剂的交互作用显著影响了DM、NDF和EE含量, 对其他营养指标无显著影响, 这是因为本试验在青贮前, 原料含水量晾晒至55%~60%, 属于半干青贮, 而水分含量与原料DM和EE含量密切相关。其他营养指标虽然也受原料含水量影响, 但与水分含量关系并不密切。因此, 两因素的交互作用只影响DM、NDF和EE含量, 而未对其他指标有显著的影响。