引用本文
刘燕, 于美玲, 张然, 牛奎举, 李玉珠, 张金青, 马晖玲. 甘肃野生草地早熟禾内源激素含量的变化与无融合生殖率的关系研究. 草业学报, 2020,29(7): 99-111
LIU Yan, YU Mei-ling, ZHANG Ran, NIU Kui-ju, LI Yu-zhu, ZHANG Jin-qing, MA Hui-ling. The relationship between endogenous hormone content and apomixis rate of wild Kentucky bluegrass in Gansu Province. Acta Prataculturae Sinica,2020,29(7): 99-111  
Doi:10.11686/cyxb2019454
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甘肃野生草地早熟禾内源激素含量的变化与无融合生殖率的关系研究
刘燕, 于美玲, 张然, 牛奎举, 李玉珠, 张金青, 马晖玲*
甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃 兰州 730070
*通信作者Corresponding author. E-mail: mahl@gsau.edu.cn

作者简介:刘燕(1992-),女,山东临沂人,在读硕士。E-mail: 568486354@qq.com

收稿日期: 2019-10-23
基金项目:国家自然科学基金项目(31760699)资助
摘要

为探究甘肃野生草地早熟禾无融合生殖率与内源激素之间的关系,以8个不同无融合生殖率的甘肃野生草地早熟禾种质为试验材料,采集不同发育时期的新鲜小穗样品,测定玉米素(ZT)、吲哚-3-乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)的含量,并分析了内源激素含量与无融合生殖发生的关系。结果表明:ZT和ZR在小穗发育初期呈现出下降趋势,在抽穗后2 d最低,之后ZT逐渐上升而ZR在开花期达到峰值后又开始下降,GA3和IAA均表现出先增加后下降的趋势,但GA3在抽穗后2 d达到峰值,IAA则是在开花期含量最高;研究发现,在小穗发育初期,无融合生殖率较低的材料(甘南、清水、肃南和兰州)ABA激素水平无显著变化,相反无融合生殖率较高的材料(陇西、秦州、定西和陇南)的ABA含量均呈现出逐渐下降的趋势,所有材料开花期至乳熟期均出现猛增,之后又急剧下降。相关性分析结果表明:无融合生殖率与ZT、ZR、ABA、(ZT+ZR)/IAA和(ZT+ZR)/ABA呈显著正相关,与GA3、IAA/ABA和GA3/ABA呈显著负相关,与IAA无显著相关性。因此,高ZT、ZR和低ABA含量、高(ZT+ZR)/IAA和(ZT+ZR)/ABA比值更可能促进胚珠向无融合生殖途径发育,高GA3含量可能促进胚珠向有性生殖途径发育。

关键词: 草地早熟禾; 高效液相; 无融合生殖; 内源激素
The relationship between endogenous hormone content and apomixis rate of wild Kentucky bluegrass in Gansu Province
LIU Yan, YU Mei-ling, ZHANG Ran, NIU Kui-ju, LI Yu-zhu, ZHANG Jin-qing, MA Hui-ling*
College of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of Education Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province, Sino-U.S.Centers for Grazing Land Ecosystem Sustainability, Lanzhou 730070, China
Abstract

To investigate the relationship between apomixis rate and endogenous hormone levels in Kentucky bluegrass, eight wild Kentucky bluegrass strains with different apomixis rates, collected in Gansu Province, were studied. Fresh spikelets were harvested at different development stages, and the contents of zeatin (ZT), indole-3-acetic acid (IAA), trans-zeatin-riboside (ZR), gibberellin (GA3) and abscisic acid (ABA) were determined, and the relationship between apomixis development and endogenous hormone levels analyzed. It was found that: ZT and ZR contents showed a downward trend during early spikelet development, and were lowest 2 days after heading, then ZT content gradually increased and ZR content began to decline after peaking at flowering stage. GA3 and IAA showed a trend of first increasing and then declining, but GA3 content reached a peak 2 days after heading, while IAA content was highest during the flowering stage. In addition, during the early stages of spikelet development, there was no significant change in ABA levels in genotypes with low apomixis (Gannan, Qingshui, Sunan and Lanzhou), but showed a decreasing trend in highly-apomictic genotypes (Longxi, Qinzhou, Dingxi and Longnan). However, ABA levels sharply increased from flowering to milk ripening, and then decreased sharply in two genotypes. Correlation analysis showed that the apomixis rate was positively correlated with ZT, ZR, ABA, (ZT+ZR)/IAA and (ZT+ZR)/ABA; negatively correlated with GA3, IAA/ABA and GA3/ABA; but failed to correlate with IAA. Therefore, high ZT, ZR and low ABA contents, (ZT+ZR)/IAA and (ZT+ZR)/ABA ratio are associated with promotion of apomictic ovule development, while high GA3 content appears to promote ovule development by the sexual pathway.

Keyword: Kentucky bluegrass; high performance liquid phase; apomixis; endogenous hormone

早熟禾属(Poa)是禾本科最大的属[1], 广泛分布于寒带和温带等冷凉湿润地区, 是草原与草甸植被组成中的重要成分[2, 3]。该属植物不仅是优良的牧草, 同时由于具有质地纤细、再生能力和耐修剪性强、绿期长、坪质优美以及较强的抗寒能力等优良特性, 被广泛应用于草坪建植中, 是宝贵的草坪植物种质资源[4]。

无融合生殖是通过种子产生无性系后代、不经雌雄配子结合而产生胚和种子的一种特殊的植物生殖方式[5, 6, 7], 其特点是母本基因型的完全复制, 不需要父本的参与[8]。正是这个特点给作物育种和种子生产带来了极大的想象空间和巨大的潜在价值, 其在作物育种与种子生产上的优势显而易见[9]:作物任何形式的杂种优势都可以由无融合生殖代代相传, 一旦将无融合生殖性状引入有性生殖的农作物, 可以极大地简化育种程序并缩短育种时间; 有利于综合抗病虫和高产稳产新品种的选育; 改善作物的繁殖技术; 因此无融合生殖育种被誉为经济与社会价值都将超出“ 绿色革命” 的“ 无性革命” [10]。

植物激素是一种植物体内自身代谢合成产生的、天然存在于植物体内的有机化合物[11], 它产生于植物本身, 同时又在不同水平上对植物的生长发育和生命活动进行调控, 并在植物性别决定中起关键的调节作用[12]。因此, 对植物激素的研究, 不仅是了解植物生长发育基本规律的途径, 而且是对植物遗传、化学和环境调控的有效手段, 所以植物激素的研究与应用具有十分重要的理论意义和广阔的应用前景[13]。Mené ndez等[14]探讨了生长素和赤霉素在无配子胚胎发育中的促进作用, 发现乙酸萘酚(naphthol as acetate, NAA)和赤霉素(gibberellins, GA3)促进近缘鳞毛蕨(Dryopteris fragrans)发生配子现象; 殷朝珍[15]对草地早熟禾(Poa pratensis)研究结果表明3个品种的内源激素含量有明显的差异。胚珠或胚囊细胞内高水平的细胞分裂素(cytokinin, CK)和低水平的脱落酸(abscisic acid, ABA)或者高的玉米素核苷(trans-zeatin-riboside, ZR)/ABA可能是不同生殖途径发育的重要调控因子, 会引发无融合生殖的发生。近十年来国内外学术界对草地早熟禾无融合生殖的研究大多局限在细胞胚胎学发生上, 对草地早熟禾花蕾在不同发育阶段内源激素含量动态变化的研究相对较少。然而越来越多的研究表明植物生长发育的各个阶段都受到内源激素的调节与控制, 激素信号可能在植物无融合生殖中的基因表达中起重要的调控作用, 基因的表达受激素调控, 而无融合生殖是基因表达的结果, 因此有必要从植物激素入手来了解无融合生殖的遗传机理。

本课题组前期已通过细胞胚胎学的研究对甘肃地区野生草地早熟禾种质的无融合生殖发育方式和频率进行了鉴定, 本研究重点开展不同无融合生殖率的种质在小穗的发育过程中内源激素含量及平衡之间的动态研究, 旨在揭示甘肃野生早熟禾无融合生殖发生激素调控的机理, 探讨激素在无融合生殖发育过程中的作用, 为实现重要农作物的无融合育种提供理论和技术支持。

1 材料与方法
1.1 试验地概况

试验于2017年10月至2018年12月在甘肃农业大学草坪实训基地、草类种质创新实验室以及甘肃农业大学国家重点实验室进行。位于兰州西北郊区, 地处东经103° 34', 北纬36° 5'。地势由西北向东南倾斜, 海拔1517.3 m, 属中温带气候区, 内陆性气候特征明显, 四季分明, 光照充足, 气候干燥, 易干旱。年降水量350 mm, 年蒸发量1664 mm。年平均气温10.3 ℃。无霜期171 d。该基地土壤以黄土壤为主, 土层深厚, 含有机质2.83%, 全氮0.09%, 速效氮49.88 mg· kg-1, 速效钾173.19 mg· kg-1, pH值7.69。

1.2 试验材料

试验材料为8个野生草地早熟禾:分别采集于甘肃清水、陇西、肃南、甘南、定西、秦州、兰州、陇南等地; 将各种质种子经过人工清选、自然干燥后, 于2017年4月20日单株定植在甘肃农业大学草坪草种质资源圃内, 后期精心灌溉、施肥、除草, 并定期多次间苗, 保证草地早熟禾单株生长。2018年4月中下旬草地早熟禾抽穗后, 采集不同时期(孕穗期至蜡熟期)的小穗, 采样时长45 d, 不同种质材料抽穗时期不同, 共采集20余次, 每个种质材料不同时期采集3~4 g, 3次重复。无融合生殖率如表1。

表1 甘肃野生草地早熟禾无融合生殖率 Table 1 Apomictic rate of wild Kentucky bluegrass in Gansu Province
1.3 植物激素提取

激素提取液的制备及分析参照张锁科[16]、罗梦娜等[17]、张咏梅等[18]的方法, 并稍做改动。

称取新鲜小穗2 g, 加液氮迅速研磨至粉末状, 加20 mL预冷的80%甲醇溶液迅速转移到50 mL离心管。4 ℃避光摇床(YJY-880, 上海)(180 r· min-1)浸提(6~8 h), 后置于4 ℃冰箱(DW-86L388J, 青岛)避光浸提过夜(16~22 h)。4 ℃ 10000 r· min-1离心机(H185OR, 湖南)离心15 min, 吸取上清液, 剩余残渣再加适量(10 mL)80%冷甲醇经漩涡仪混匀后4 ℃超声提取5~10 min, 同样条件下离心10 min, 合并上清液, 弃去残渣。全部上清液(25~30 mL)于真空离心浓缩仪(RVC 2-25 CDplus, 德国)中40 ℃减压浓缩至20 mL, 加入石油醚10 mL摇匀静置脱色处理一次, 再加10 mL石油醚重复脱色一次, 10000 r· min-1离心10 min, 留液相(下层)弃醚相(上层), 液相继续浓缩至原来的1/3, 用10 mL乙酸乙酯萃取2次, 第一次静置, 第二次相同条件离心, 留酯相(上层)合并上清液, 全部上清液于40 ℃下减压浓缩近干, 2 mL色谱甲醇复溶, 4 ℃避光保存。经0.22 μ m微孔有机滤膜过滤, 运用四元梯度超快速液相色谱仪(ACQUITY Arc, 美国)测定早熟禾无融合生殖内源激素吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、GA3、ABA、ZR、玉米素(zeatin, ZT)含量, 进行高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)分析。

1.4 色谱条件及流动相的选择

参照张咏梅等[18]和张玉琼等[19]的方法, 并稍做改动。

色谱柱:Eclipse Plus C18柱(4.6 mm× 250 mm, 5 μ m); 柱温:30 ℃; 进样量:5 μ L; 可变波长检测器(variable wavelength detector, VWD)波长:254 nm; 流速:1.0 mL· min-1; 定量方法:外标峰面积法[16]; 流动相浓度比例梯度如表2。

表2 流动相条件比例 Table 2 Proportion of mobile phase conditions
1.5 数据统计与分析

采用SPSS 19.0进行数据统计和分析, 采用Excel 2013作图。

2 结果与分析
2.1 标准样品保留时间、回归方程和相关系数

标准样品分离谱如表3所示, ZR、ZT、GA3、IAA、ABA保留时间分别为3.232、4.253、5.998、7.931、8.755 min, 吸收峰之间分离良好, 互不干扰, 本试验提取方法和色谱条件较为可靠。以5种激素的标准溶液为原液进行逐级稀释, 在优化的色谱条件下分析, 以峰面积为纵坐标(Y), 标样浓度为横坐标(X, μ g· mL-1), 计算各内源激素的回归方程和相关系数。玉米素核苷、玉米素、赤霉素、生长素和脱落酸的线性相关系数分别为0.99923、0.99948、0.99974、0.99907、0.99949。标准品浓度与峰面积的相关系数均大于0.999, 相关性良好。

表3 出峰时间、回归方程和相关系数 Table 3 The peak time, regression equation and correlation coefficient
2.2 甘肃野生草地早熟禾内源激素含量及动态平衡变化

2.2.1 甘肃野生草地早熟禾ZT含量动态变化 由图1可看出, 各种质材料不同发育时期都表现出先下降后上升的趋势, 在抽穗后2 d ZT含量下降到最低点, 除肃南和兰州外其他6个种质抽穗后2 d的ZT含量都显著低于其他5个时期, 兰州抽穗后2 d与开花期的ZT含量差异不显著(P> 0.05), 肃南抽穗后2 d与抽穗期和开花期的ZT含量差异不显著(P> 0.05); 甘南在抽穗后2 d ZT含量最低, 为87.36 μ g· g-1, 陇南在抽穗后2 d ZT含量是988.36 μ g· g-1, 与其他5个时期差异显著(P< 0.05); 随后ZT含量开始增加, 到蜡熟期增加到最高点, 陇南蜡熟期的ZT含量最高, 达到1310.56 μ g· g-1, 显著高于其他时期。

图1 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期ZT含量变化
不同大写字母表示同一发育时期不同种质间的差异显著(P< 0.05); 不同小写字母表示同一种质不同发育时期的差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.1 Change of ZT contents in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province
Different capital letters indicate significant differences of different Kentucky bluegrass varieties in the same developing stages at 0.05 level; Different small letters indicate significant differences of the same varieties in the different developing stages at 0.05 level. The same below.

同一发育时期不同种质材料ZT含量也有一定的差异, 孕穗期、抽穗后2 d和蜡熟期各种质之间差异均显著(P< 0.05), 抽穗期、开花期和乳熟期陇西和秦州之间差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05); 清水和兰州在开花期差异不显著, 与其他种质差异显著(P< 0.05)。

2.2.2 甘肃野生草地早熟禾ZR含量动态变化 各种质材料的ZR含量在前期有逐渐降低的趋势但变化幅度较小(图2), 抽穗后2 d ZR含量下降到最低, 甘南的ZR含量最低, 为410.58 μ g· g-1, 与其他时期ZR含量差异显著(P< 0.05), 但在开花期出现猛增的现象, 甘南增幅最大, 为63.42%, 其次是陇西和陇南, 增幅分别为45.46%, 41.77%, 开花期陇南的ZR含量最高, 为2092.75 μ g· g-1, 显著高于其他5个时期。

图2 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期ZR含量变化Fig.2 Change of ZR contents in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期、抽穗后2 d时, 清水、肃南、兰州和陇西的ZR含量差异不显著(P> 0.05), 陇南、定西、秦州和甘南差异显著(P< 0.05); 抽穗期陇南的ZR含量显著高于其他种质; 乳熟期清水和甘南的ZR含量显著低于其他6个种质; 蜡熟期陇南和定西、兰州的ZR含量差异不显著(P> 0.05), 但显著高于其他5个种质。

2.2.3 甘肃野生草地早熟禾GA3含量动态变化 从图3可以看出, 各种质材料GA3含量是先上升后下降, 在抽穗后2 d出现峰值, GA3含量达到最大, 且与其他5个时期差异显著(P< 0.05), GA3含量最高的是甘南, 可高达19738.81 mg· g-1, 相比之下陇南的峰值最低, 为4235.53 mg· g-1, 与其他5个时期差异显著(P< 0.05)。各种质材料在蜡熟期均下降到最低点, 甘南的GA3含量最低点比最高点降低了211.33%, 此时期GA3含量最低的是陇南, 为2137.44 mg· g-1, 显著低于其他5个时期; 孕穗期、抽穗期、开花期和蜡熟期阶段, 各种质材料之间差异均显著(P< 0.05), 抽穗后2 d兰州和陇西的GA3含量差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05), 乳熟期兰州和肃南的GA3含量差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05)。

图3 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期GA3含量变化Fig.3 Change of GA3 contents in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

2.2.4 甘肃野生草地早熟禾IAA含量动态变化 草地早熟禾各种质材料的IAA含量变化趋势跟GA3含量变化趋势基本一致, 都是先升高后降低, 不同的是GA3含量在抽穗后2 d增加到最大值而IAA在开花期增加到最大值且在乳熟期出现骤降现象(图4), 甘南的IAA含量最高, 为11253.3 μ g· g-1, 显著高于其他5个时期, 其他各种质材料最高值均显著高于其他5个时期, IAA含量最低的是蜡熟期的清水, 是1152.8 μ g· g-1, 显著低于其他5个时期。

图4 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期IAA含量变化Fig.4 Change of IAA contents in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期秦州的IAA含量与其他种质差异显著(P< 0.05), 抽穗期定西和陇南、肃南的IAA含量差异不显著(P> 0.05), 但均与其他5个种质材料的IAA含量差异显著(P< 0.05), 抽穗后2 d、开花期和乳熟期甘南的IAA含量显著高于其他种质材料, 蜡熟期陇南和秦州的IAA含量差异不显著(P> 0.05), 与其他种质材料的IAA含量差异显著(P< 0.05)。

2.2.5 甘肃野生草地早熟禾ABA含量动态变化 由图5可以看出, 各种质材料的ABA含量变化在孕穗期、抽穗期和抽穗后2 d的规律性不统一, 甘南、清水、肃南和兰州在此时期内几乎没什么变化, 幅度非常小, 且差异不显著, ABA含量最低的是孕穗期的甘南, 为90.4 μ g· g-1, 但陇西、秦州、定西和陇南的ABA的含量在此时期出现下降的状态, 抽穗后2 d下降到最低值, 所有种质都在开花期有所上升, 而且在乳熟期急剧增加达到6个时期的最大值, 陇南的ABA含量达到最高, 为806.0 μ g· g-1, 与其他时期差异显著(P< 0.05)。

图5 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期ABA含量变化Fig.5 Change of ABA contents in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期陇南的ABA含量与其他种质的ABA含量差异显著(P< 0.05), 甘南、清水和肃南ABA含量差异不显著(P> 0.05)。抽穗期陇南和定西的ABA含量差异不显著(P> 0.05), 与其他6个种质的ABA含量差异显著(P< 0.05), 抽穗后2 d所有种质之间ABA含量差异不显著(P> 0.05), 开花期陇南和定西、陇西、兰州之间ABA含量差异不显著(P> 0.05), 与另外4个种质之间差异显著(P< 0.05), 乳熟期陇南的ABA含量与清水和肃南差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05), 蜡熟期甘南和清水的ABA含量差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05), 陇南的ABA含量与其他种质差异均显著(P< 0.05)。

2.2.6 甘肃野生草地早熟禾(ZT+ZR)/IAA变化 各草地早熟禾种质材料的(ZT+ZR)/IAA变化趋势基本一致, 即先下降, 在抽穗后2 d下降到最低点后又上升, 甘南和清水的(ZT+ZR)/IAA在开花期和乳熟期缓慢上升, 而其他种质急剧增加, 蜡熟期达到最高值(图6)。除了肃南和定西的抽穗后2 d和开花期差异不显著外其他种质的最低点均与其他时期差异显著(P< 0.05), 各种质蜡熟期均与其他时期差异显著(P< 0.05), 甘南抽穗后2 d的(ZT+ZR)/IAA最低, 为0.05, 与其他时期差异显著(P< 0.05), 陇西的(ZT+ZR)/IAA在蜡熟期达到最大值, 为1.31, 与其他时期差异显著(P< 0.05)。

图6 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期(ZT+ZR)/IAAFig.6 (ZT+ZR)/IAA in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期、抽穗期、抽穗后2 d和开花期中, 陇南的(ZT+ZR)/IAA显著高于其他种质, 乳熟期定西的(ZT+ZR)/IAA显著高于其他种质, 蜡熟期陇西和陇南的(ZT+ZR)/IAA差异不显著但显著高于其他种质。

2.2.7 甘肃野生草地早熟禾(ZT+ZR)/ABA变化 由图7可以看出, 各草地早熟禾种质材料的(ZT+ZR)/ABA变化趋势不一, 甘南的(ZT+ZR)/ABA变化趋势与陇西、秦州、定西和陇南变化趋势相反, 呈“ W” 型, 清水、肃南和兰州的比值变化趋势成“ V” 型, 陇西、秦州、定西和陇南的比值变化趋势则呈“ N” 型, 甘南、清水和肃南的(ZT+ZR)/ABA在孕穗期最大, 分别为9.27、13.73、12.99, 且显著高于其他5个时期, 兰州在孕穗期该比值达到峰值, 为12.21, 但与抽穗期和抽穗后2 d差异不显著(P> 0.05), 陇西、秦州、定西和陇南的(ZT+ZR)/ABA在抽穗后2 d达到最大, 最大值分别为12.91、15.29、16.78、18.31。

图7 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期(ZT+ZR)/ABAFig.7 (ZT+ZR)/ABA in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期清水、肃南和兰州的(ZT+ZR)/ABA显著高于其他5个种质, 抽穗期陇西、秦州、定西、清水和陇南的(ZT+ZR)/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他3个种质的差异显著(P< 0.05), 抽穗后2 d秦州、定西和陇南的(ZT+ZR)/ABA差异不显著(P> 0.05), 兰州、陇西和肃南的(ZT+ZR)/ABA差异不显著(P> 0.05), 甘南与清水两种质的(ZT+ZR)/ABA差异显著(P< 0.05), 开花期陇南的(ZT+ZR)/ABA显著高于其他材料, 乳熟期定西和陇南的(ZT+ZR)/ABA显著高于其他参试材料(P< 0.05), 蜡熟期陇西、秦州、定西和陇南的(ZT+ZR)/ABA差异不显著(P> 0.05), 但显著高于其他种质材料, 此时期清水、陇西和陇南的(ZT+ZR)/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他5个种质差异显著(P< 0.05)。

2.2.8 甘肃野生草地早熟禾GA3/ABA变化 各草地早熟禾种质材料的GA3/ABA变化趋势基本一致, 即先上升, 在抽穗后2 d上升到最高点后又骤降(图8)。甘南和清水的GA3/ABA在乳熟期最小, 分别为16.35和10.44, 两者与蜡熟期差异不显著(P> 0.05), 与其他4个时期差异显著(P< 0.05), 肃南、兰州、陇西、秦州、定西和陇南的最小值在蜡熟期, 分别为8.74、8.92、7.43、7.33、5.12、3.57, 除陇西蜡熟期与乳熟期差异显著(P< 0.05)外, 其他材料蜡熟期与乳熟期差异不显著(P> 0.05)。

图8 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期GA3/ABAFig.8 GA3/ABA in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

整个发育时期, 甘南的GA3/ABA高于其他种质且差异显著(P< 0.05), 孕穗期和抽穗期陇西和秦州的GA3/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05), 定西和陇南的GA3/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他种质差异显著(P< 0.05)。在抽穗后2 d及蜡熟期的肃南、兰州、陇西和秦州的GA3/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他4个种质差异显著(P< 0.05), 开花期各种质之间差异显著(P< 0.05), 乳熟期清水和兰州差异不显著, 与其他6个种质差异显著(P< 0.05)。

2.2.9 甘肃野生草地早熟禾IAA/ABA变化 分析图9可以看出, 各草地早熟禾种质材料的IAA/ABA变化趋势基本与GA3/ABA变化趋势保持一致, 即在抽穗后2 d上升到最高点后又在开花期骤降。蜡熟期最小, 各种质材料乳熟期和蜡熟期的IAA/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他4个时期差异显著(P< 0.05)。

图9 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期IAA/ABAFig.9 IAA/ABA in the different developing stages of Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期甘南的IAA/ABA与其他7个种质材料差异显著(P< 0.05), 抽穗期甘南和清水的IAA/ABA差异不显著(P> 0.05), 与其他6个种质材料差异显著(P< 0.05), 抽穗后2 d除甘南外其他种质材料的IAA/ABA差异均不显著(P> 0.05), 开花期甘南仍与其他材料差异显著(P< 0.05), 乳熟期兰州和秦州的IAA/ABA差异不显著, 与其他种质差异显著(P< 0.05), 蜡熟期秦州的IAA/ABA与其他7个种质材料差异显著(P< 0.05), 清水和兰州、定西的IAA/ABA差异不显著(P> 0.05)。

2.3 甘肃野生草地早熟禾内源激素含量及动态平衡之间相关性分析

运用SPSS对甘肃野生草地早熟禾高频和低频种质材料不同发育时期内源激素含量及动态平衡之间进行相关性分析可得, 各发育时期的GA3含量、IAA/ABA和GA3/ABA与无融合生殖率基本呈负相关性, 其他的呈正相关(表4)。

表4 甘肃野生草地早熟禾不同发育时期内源激素含量及动态平衡之间相关性(双侧) Table 4 Correlation (bilateral) between endogenous hormone content and balance in different development stages of wild Kentucky bluegrass in Gansu Province

孕穗期的ZT、ZR、GA3和ABA含量以及GA3/ABA与无融合生殖率极显著相关, 相关系数分别为0.854、0.926、0.960、0.847和0.971; 抽穗期时除了IAA含量与无融合生殖率不显著相关外(相关系数0.673), 其他的均与无融合生殖率呈极显著相关; 抽穗后2 d除ABA含量与无融合生殖率不显著相关, 其他的均与其极显著相关; 开花期的(ZT+ZR)/ABA与无融合生殖率不显著相关, 相关系数仅为0.327, 其他的均与无融合生殖率呈极显著相关; 乳熟期的ZR含量、(ZT+ZR)/IAA、IAA/ABA和GA3/ABA与无融合生殖率极显著相关, ZT、GA3、IAA、ABA含量和(ZT+ZR)/ABA与无融合生殖率呈显著相关; 蜡熟期其除与IAA/ABA不显著相关外, 相关系数仅为0.219, 无融合生殖率与ZT、IAA、ABA含量、(ZT+ZR)/IAA和(ZT+ZR)/ABA与无融合生殖率显著相关, 相关系数分别为0.834、0.724、0.833、0.719和0.772, 与ZR、GA3含量和GA3/ABA极显著相关; 从整个发育时期来看, IAA含量与无融合生殖率不显著相关, 相关系数为0.669, 无融合生殖率与其他内源激素以及内源激素平衡相关性极显著, 相关系数最高可达0.993。

3 讨论与结论
3.1 甘肃野生草地早熟禾内源激素含量与无融合生殖的关系

植物生长的各个发育时期, 都受到内源激素的调节与控制[20]。在对小麦(Triticum aestivum)品种兰考矮早八的不同发育阶段的研究发现, 内源激素调节作用存在差异, 小花原基分化期穗内GA3含量较高, 不利于大穗的形成[21]; 高含量的IAA可能是诱导小花退化的启动因子[22]; 在小麦小花发育进程中穗内源激素ZR在药隔形成期起关键作用; 较高含量的ABA在四分体形成期显著抑制小花的发育[23]。穗内较高的IAA、GA3和ZR含量是形成较多结实粒数的重要生理基础, 在许多植物中, 各种植物激素在花发育中起重要的调节作用和影响性别分化[24], 内源激素在植物性别决定中起关键的调节作用[25], 无融合生殖与杂合性、多倍性及不育性等关系密切[26]。

本研究结果显示, 在草地早熟禾不同发育时期, 不同无融合生殖种质材料的内源激素含量有明显的差异, GA3和IAA含量与无融合生殖率基本呈负相关性, ZT、ZR和ABA含量与之呈正相关。从整个发育时期来看, IAA含量与无融合生殖率不显著相关, 无融合生殖率与其他内源激素含量相关性极显著。无融合生殖率高的材料ZT、ZR的含量较高, 基本上表现为随着早熟禾无融合生殖率的增加, ZT和ZR含量也会随之增加, 可能早熟禾植物中较高的细胞分裂素含量能促进胚珠向无融合生殖途径发育; 而无融合生殖率低的材料GA3的含量相对较高, GA3促进细胞分裂, 可能在此阶段赤霉素促进草地早熟禾进行减数分裂, 而无融合生殖不经过减数分裂, 所以较高的GA3含量会促进胚珠向有性生殖途径发育; IAA的主要作用是调节茎的生长速率、抑制侧芽、促进生根等[27], 对无融合生殖材料没有直接的相关性, 无论是无融合生殖率低的材料还是无融合生殖率高的材料, IAA含量在开花期以前都逐渐升高, 促进草地早熟禾小穗的生长, 并没有对草地早熟禾向无融合生殖发展还是向有性生殖发展产生直接的作用; 抽穗期ABA含量的高低对草地早熟禾向有性生殖发展还是无融合生殖发展起关键作用, 无融合生殖率低的材料在孕穗期至抽穗后2 d的ABA含量几乎没什么变化, 无融合生殖率高的材料在抽穗后2 d的ABA含量会下降, 说明低含量的脱落酸促进胚珠向无融合生殖途径发育。殷朝珍[15]研究结果表明, 子房内较低的ABA含量和较高的t-ZR含量可能有利于胚珠向无融合生殖途径发育。

3.2 甘肃野生草地早熟禾内源激素的动态平衡与无融合生殖的关系

由于不同激素共存于同一植物体中, 它们出现的时间和含量不同, 其作用错综复杂, 而且还受外界条件的影响, 各种激素相克相成的结果就会产生一种平衡状态[28], 因而决定生理效应的往往不是某种激素的绝对量, 而是各激素间的相对含量[29], 许多研究表明, 激素处理能诱导新的mRNA和蛋白质的合成, 说明激素的许多作用是通过调节基因表达的方式实现的[30], 目前认为激素是植物信号传导的最重要的调节因子。杨代常等[31]和袁隆平[32]也认为激素对基因的表达调控不仅取决于某种激素含量的增加或减少, 更重要的是通过激素间平衡实现的; 从根本上讲植物生长发育是受遗传基因控制的, 植物激素的平衡可以决定控制某一性状或发育过程的发生的遗传信息是否表达, 从而影响代谢过程改变生长发育特性[33]。植物无融合生殖当然也是由遗传基因控制的, 无融合生殖基因的表达调控也应当受到激素的影响。已有证据证明在草地早熟禾生长发育阶段, 无融合生殖与内源激素之间相互促进[15]。

从本研究结果来看, 不同发育阶段的内源激素动态平衡存在相互作用, GA3/ABA和IAA/ABA与无融合生殖率基本呈负相关性, (ZT+ZR)/ABA和(ZT+ZR)/IAA呈正相关。从整个发育时期来看, 无融合生殖率与内源激素动态平衡之间相关性显著。无融合生殖率高的种质其(ZT+ZR)/IAA和(ZT+ZR)/ABA明显高于无融合生殖率低的种质, 这表明高的(ZT+ZR)/IAA和(ZT+ZR)/ABA更有利于草地早熟禾向无融合生殖途径发育, 这也印证了殷朝珍[15]的结果:“ 无融合生殖小穗发育过程中, 高的ZR/ABA可能引起了无融合生殖的发生” , 徐映萍[34]指出, 生长素与细胞分裂素配合能引起细胞分裂, 本研究结果与之相似; 此外, IAA/ABA和GA3/ABA较高会造成无融合生殖率偏低, 从单激素调控来看, IAA对无融合生殖并没有直接性的作用, 高的GA3含量可能有利于草地早熟禾向有性生殖途径发育, 而低的ABA含量有利于草地早熟禾向无融合生殖途径发育。对茶树(Camellia sinensis)和白皮松(Pinus bungeana)插穗生根过程中内源激素研究, 认为IAA/ABA大致可以表示插穗的生根力, 其比值高, 生根率较高[35, 36, 37]; 王英等[38]认为棕榈(Trachycarpus fortunei)内GA3/ABA的增高有利于雌花的生长发育, IAA与ABA这两种激素相互作用很难推断这种内源激素的平衡比值升高或降低是否与其生殖途径的调控有关, 还需进一步研究。也有研究表明[39, 40, 41, 42], 内源激素可能是通过动态变化以及平衡变化的方式对穗花分化进行调控的, 一种植物激素对不同植物具有雌性化或雄性化的作用, 一些植物性别分化是由多种植物激素共同作用的结果。

本试验研究结果表明高的ZT、ZR含量和低的ABA含量、高的(ZT+ZR)/IAA和(ZT+ZR)/ABA更有利于草地早熟禾内胚珠向无融合生殖途径发育, 如果想得到无融合生殖率高的草地早熟禾种质, 可以在生产实践上喷施相关外源激素来提高草地早熟禾的无融合生殖率, 这在农业生产上将会有重要的意义。

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