试验于2019年1月在东北农业大学生命科学学院实验楼温室中进行。紫花苜蓿龙牧806购自黑龙江省畜牧研究所。编号为BGC XJ08A摩西球囊霉菌购自北京农林科学院, 耐碱苜蓿中华根瘤菌(CCBAU 81024)购自中国农业大学根瘤菌资源保存中心。

培养基质选用河沙(流水冲洗15 min, 最后蒸馏水冲洗一次, 125 ℃高温灭菌2 h)。

试剂:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、脯氨酸、可溶性糖试剂盒购自苏州科铭生物技术有限公司。

1.2.1 紫花苜蓿的培养及碱胁迫处理 为了提高种子的萌发率, 对紫花苜蓿种子进行春化, 75%乙醇消毒, 10%次氯酸钠灭菌5 min, 无菌水充分冲洗, 最后将种子放在铺有湿润滤纸的培养皿上, 置于培养箱(光照16 h, 25 ℃)中萌发, 一周后, 沙土移栽, 同时接种丛枝菌根真菌的处理组(AI)在土层下2 cm处放置2.5 g摩西球囊霉菌(BGC XJ08A), 接种根瘤菌的处理组(RI)用根瘤菌液浸泡幼苗, 更有益于侵染, 然后移栽, 同时设置未接菌处理组(NI)。混接丛枝菌根真菌和根瘤菌的处理组重复以上两项操作。幼苗期, 浇灌1/5倍的霍格兰营养液, 4周后, RI和混合接种摩西球囊霉菌-根瘤菌(MI)组植株浇灌无氮营养液, 以激活根瘤菌, 并在每月定期接种根瘤菌。16周后, 选取长势基本一致的4组植株, 用100 mmol· L^-1, pH 8.5 NaHCO₃溶液碱胁迫处理, 分别在0、5和8 d取样, 每组30株样本, 单株取样, -80 ℃保存备用。

1.2.2 根长、株高、分枝数及相对含水量测定 根长、株高和分枝数:用直尺测量根长、株高, 计数法测分枝数, 最后求均值。

相对含水量(relative water content, RWC)=(W_f-W_d)/(W_t-W_d)× 100%

式中:W_f表示组织鲜重; W_d表示组织干重; W_t表示组织被水分饱和后重量。

1.2.3 侵染率的测定 选取AI和MI组植株根部, 经蒸馏水冲洗1 min, 剪成长度约2 cm根段若干份, 对根段进行透明、酸化、染色、脱色、复染等处理后制片观察。

侵染率=侵染区总面积/视野总面积× 100%

1.2.4 叶绿素含量的测定 用TYS-B型号(中国峰龙化学仪器公司)叶绿素仪测定植株叶绿素含量。

1.2.5 相对电导率的测定 采用抽真空方法测定叶片电导率。

1.2.6 生理指标测定 采用可见分光光度法测定丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量; 采用紫外分光光度法测定超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性, 具体实验操作参考相应试剂盒说明书。

采用Graph Pad Prism 5统计分析试验数据标准差、方差并作t-检验处理, 分析单接种植株生理生化指标与混合接菌植株的差异, P< 0.05标注显著性字母。

比较了混合接种根瘤菌与摩西球囊霉菌(MI)和单接种摩西球囊霉菌(AI)侵染率的差异, 由图1所示, A图中的泡囊数明显少于B图, AI和MI侵染率存在差别, 并且MI的侵染率是AI的1.47倍, 差异性显著(P< 0.05)。由此可知, 接种根瘤菌有利于摩西球囊霉菌的侵染率。

图1

Fig.1

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图1 单接种摩西球囊霉菌和混合接种摩西球囊霉菌-根瘤菌植株根部侵染率 A:单接种摩西球囊霉菌植株根部镜检Single inoculation of root examination images of AMF plants; B:混合接种摩西球囊霉菌-根瘤菌植株根部镜检Microscopic inoculation of root examination images of AMF-rhizobium plants; C:统计图Statistical chart; AI:单接种摩西球囊霉菌Inoculated AMF; MI:混合接种摩西球囊霉菌-根瘤菌Inoculated AMF and rhizobium。不同字母表示P< 0.05 水平差异显著。下同。Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same below.Fig.1 Root infection rate of single inoculation of AMF plants and mixed inoculation AMF-Rhizobium plants

比较不同接菌处理后植株的生长状态, 即株高、根长和分枝数, 各组植株株高、根长均存在不同差异(图2)。MI的株高最高, 分别与NI和RI产生显著差异(P< 0.05), 且是它们的1.12和1.19倍。接菌组AI、RI和MI根长相差不大, 但与未接菌组NI比, 差异显著(P< 0.05), 分别是NI的1.21、1.09、1.27倍。4组植株分枝数比较发现, AI与NI和RI植株间存在显著性差异(P< 0.05), 且分别是NI和RI的1.42、1.38倍。MI与NI和RI植株也存在显著性差异, 分别是NI和RI的1.59、1.63倍, 由此知接种摩西球囊霉菌可以提高苜蓿分枝数, 且与根瘤菌混接效果更佳。

图2

Fig.2

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	图2 不同接菌处理各植株的株高、根长和分枝数 NI:未接种菌No inoculated; AI:单接种摩西球囊霉菌Inoculated AMF; RI:单接种根瘤菌Inoculated rhizobium; MI:混合接种摩西球囊霉菌与根瘤菌Inoculated AMF and rhizobium.下同The same below.Fig.2 The height, root length and number of branches of NI, AI, RI and MI plants

对4组紫花苜蓿进行碱胁迫处理, 观察苜蓿表型差异(图3A)。碱胁迫处理5 d时, 4组植株生长状态均发生变化, 叶片变黄, NI植株叶片黄化明显。碱胁迫处理8 d时, NI植株生长受到抑制, 萎蔫程度最高, 叶片黄化率约为1/3。此时, 其他3组植株受损程度也有所上升, 但MI植株损伤程度相对较低, 耐碱性更好。

图3

Fig.3

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	图3 碱胁迫处理后紫花苜蓿表型、叶绿素、相对电导率和相对含水量的变化Fig.3 Differences in alfalfa phenotypic, chlorophyll, relative conductivity and relative water content after treatment with alkali stress

从相应的生理指标分析可知, 0 d时, 接菌组叶绿素含量高于未接菌组, 存在显著差异(P< 0.05, 图3B), 且AI、RI、MI组分别是NI组的1.16、1.22、1.22倍。碱胁迫8 d时, 4组植株叶绿素含量均表现下降, 且NI、AI和RI组植株与5 d时相比均产生显著差异(P< 0.05), 而MI植株叶绿素含量仍最高, 且与其他3组存在显著差异(P< 0.05), 在碱胁迫处理8 d时, NI的叶绿素含量最低, MI是NI的2.04倍。叶片的相对含水量与叶绿素含量的变化有相似的规律, 0 d时, MI植株叶片相对含水量显著高于NI植株 (P< 0.05, 图3C)。在碱胁迫8 d时, MI植株的叶片含水量并无明显变化, 但其他3组相对含水量均明显下降, 且与MI产生显著差异(P< 0.05), MI的相对含水量分别是NI、AI、RI植株的1.29、1.27、1.09倍。又测定了4组植株碱胁迫后相对电导率的变化, 结果表明, 0 d时, 4组植株相对电导率无明显差异; 碱胁迫处理后, 4组植株相对电导率均上升, RI和MI组在碱胁迫8 d 时显著上升(P< 0.05), 而NI组在碱胁迫处理5 d时便显著上升, 8 d时, NI组相对电导率分别是AI、RI、MI的1.59、1.70、2.07倍, 存在显著性差异(P< 0.05, 图3D)。综上所述, 单接根瘤菌和单接摩西球囊霉菌均能使苜蓿保持叶绿素含量和相对含水量, 并降低相对电导率, 使苜蓿更耐碱, 但是混合接种的效果更为明显。

0 d时, 各组植株根和叶中MDA含量无显著差异。碱胁迫后, NI组植株根和叶中MDA含量明显上升, 而AI、RI和MI上升趋势不明显, 尤其是MI组(图4)。碱胁迫后, AI和RI组叶片中MDA含量变化较MI大, 但都明显低于NI组。碱胁迫8 d时, NI组植株根和叶的MDA累积量最大, 与AI、RI、MI组存在显著差异(P< 0.05), 在根中分别是AI、RI、MI组植株的3.02、3.77、3.33倍, 在叶中分别是AI、RI、MI组植株的1.34、1.33、2.07倍。MDA的含量与细胞膜损伤程度呈正相关, 由以上结果可知, 单接种根瘤菌和单接摩西球囊霉菌均能降低细胞膜的损伤程度, 且混合接种的效果优于单接种。

图4

Fig.4

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	图4 碱胁迫处理后紫花苜蓿根(A)和叶(B)中 MDA 含量Fig.4 MDA content in alfalfa roots (A) and leaves (B) treated with alkali stress

碱胁迫后4组植株根和叶中3种抗氧化酶酶活变化如图5所示, 总体看, 在未经胁迫处理时, MI组根中3种酶的酶活力均不同程度的高于NI组, 其中SOD、POD、CAT显著高于NI组(P< 0.01); 而在叶中, 则表现为MI组SOD显著高于NI组(P< 0.01), 而CAT则显著低于NI组。经碱胁迫处理后, 根中NI组SOD和CAT酶活性下降, POD酶活性上升, 相比NI组, MI组3种酶酶活性变化更为显著。在碱胁迫处理8 d后, MI组SOD、POD、CAT酶活性均显著高于NI组, 分别是NI组的2.97、1.42、2.43倍。而RI和AI组中酶的活性较NI组差异并没有MI组显著, 尤其是在碱胁迫处理8 d。

图5

Fig.5

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	图5 碱胁迫处理不同时间点的紫花苜蓿根(A、C、E)和叶(B、D、F)中抗氧化酶的活性Fig.5 Activity of antioxidant enzymes in roots (A, C, E) and leaves (B, D, F) of alfalfa at different time points treated with alkaline stress

在叶中, 4组植物酶活性的表现与根中有不同之处, 但相同的是MI组3种酶的酶活性在碱处理8 d均显著高于NI组(P< 0.05)。碱胁迫处理前后, RI组SOD酶活性均高于AI组, 与MI组变化一致, 碱胁迫处理8 d更为显著。而CAT的酶活性, 则在未处理和碱胁迫8 d时表现出AI组高于RI 组。POD酶活性, AI和RI组在未经碱胁迫处理时高于NI和MI组, 并持续到碱胁迫处理5 d。碱胁迫处理8 d时, 则明显下降, 最终低于MI组。由此推测, 接种根瘤菌和菌根真菌可以有效改变不同抗氧化酶活性, 而双接种两种促生菌则可更有效的提高苜蓿在碱胁迫下的抗氧化能力。

2.6.1 脯氨酸含量变化 脯氨酸是细胞膜渗透调节的重要物质, 遭受碱胁迫的植物体中脯氨酸含量发生变化。由图6所示, 0 d时, MI组根和叶中脯氨酸含量均显著高于NI组。碱胁迫处理后, 4组植株根和叶中脯氨酸含量均显著上升。碱处理5 d时, 3组接菌植株根中脯氨酸含量均显著高于NI组; 8 d时, RI组植株脯氨酸含量显著高于其他3组。在叶中, 碱处理5 d时各组脯氨酸含量无显著差异, 8 d时RI组显著高于NI组。

图6

Fig.6

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	图6 碱胁迫处理不同时间点的紫花苜蓿根(A)和叶(B)中脯氨酸的含量Fig.6 Proline content in alfalfa roots (A) and leaves (B) treated with alkali stress at different time points

2.6.2 可溶性糖含量变化 可溶性糖不仅可为植物生长发育提供能量, 也可作为响应逆境胁迫的信号分子。由图7可知, 在根中, 0 d时, NI和MI的可溶性糖含量与AI、RI相差较大(P< 0.05); 碱胁迫5 d时, RI组可溶性糖依然显著高于其他3组; 8 d时RI和MI的可溶性糖含量显著高于NI。与根结果相似, 在叶中, 未经碱处理时, RI组中可溶性糖含量显著高于其他3组(P< 0.05), 碱处理后, 各组中可溶性糖含量均上升, 尤其是MI组, 持续显著性上升, 在碱处理8 d时, AI、RI和MI组可溶性糖含量均显著高于NI组。由此可知, 接种根瘤菌可以提高根和叶中可溶性糖含量, 碱胁迫处理后, 单接种和混合接种均可以持续提高根和叶中可溶性糖的含量以缓解渗透压。

图7

Fig.7

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	图7 碱胁迫处理不同时间点的紫花苜蓿根(A)和叶(B)中可溶性糖的含量Fig.7 Soluble sugar content in alfalfa roots (A) and leaves (B) treated with alkali stress at different time points