稻粒黑粉病菌强毒力菌株JY-521由四川农业大学植物病理实验室分离并保存。高感稻粒黑粉病水稻不育系材料9311A种子由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供。

马铃薯蔗糖琼脂(potato-sucrose-agar, PSA)固体培养基:马铃薯200.0 g, 蔗糖20.0 g, 琼脂20.0 g, 蒸馏水1 L, pH 7.0, 120 ℃高压灭菌15 min。

马铃薯蔗糖液体培养基(potato-sucrose-broth, PSB):马铃薯200.0 g, 蔗糖20.0 g, 蒸馏水1 L, pH 7.0, 120 ℃高压灭菌15 min。

1.3.1 样品制备 将稻粒黑粉病菌强毒力菌株JY-521于PSA固体培养基上活化后, 挑取单菌落于新的PSA固体培养基中, 于28 ℃恒温箱中培养3 d。水稻扬花期采集感病不育系9311A幼穗, 75%乙醇消毒2 min, 用无菌水清洗掉多余的乙醇; 杂交剪剪去颖壳一端, 使花器官露出, 放置于稻粒黑粉病菌菌落上。分别于侵染8、12、24、48和72 h刮取颖壳表面菌丝, 以不侵染菌落作为对照(8 h), 用于RNA提取。

1.3.2 样品RNA提取 采用Tri-zol法^[11]提取RNA, 用1.0%变性琼脂糖凝胶检测总RNA, 并保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.3 测序分析 利用Illumina Hiseq 2500平台进行测序, 测序模式为125PE。以本课题组完成的稻粒黑粉病菌JY-521全基因组测序作为参考基因组^[12]。使用SOAP 2软件将测序得到的过滤后读段(clean reads)比对到参考基因组。表达定量以每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments, FPKM)为单位, 参照Benjamini等^[13]调控倍性变化率(fold charge ratio, FC)的方法对P值结果进行调整。

1.3.4 差异基因表达模式分析 基于比较转录组分析, 从5个时间点的稻粒黑粉病菌中筛选到500个显著差异表达基因(different expression genes, DEGs), 根据500个基因在稻粒黑粉病菌中的表达量变化, 本研究使用Short Time-series Expression Miner (STEM)软件将其划分为24个聚类群^[15]。

1.3.5 KEGG和GO富集分析 使用R程序中的GOseq程序包对DEGs的GO功能进行富集分析^[16]; DEGs的KEGG分析使用KOBAS软件^[17]。

采用Benjamini等^[14]的方法对DEGs进行显著性分析, 以P< 0.05, |log₂fold charge|> 1为显著表达差异。KEGG和GO富集的P-value经过Bonferroni校正后, 以Corrected P-value< 0.05为显著富集。

6个样本的转录组测序共获得202624114条clean reads, 去掉接头、含N的序列和低质量的reads后, 高质量clean reads的数据量约为25.1 Gb; 在参考基因组上的比对率达70.16%~73.70%, Q₂₀介于96.51%~96.86%, GC含量为53.82%~54.85%。根据测序的clean reads和比对到参考基因组的数据, 可进行后续数据分析(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 稻粒黑粉病菌接种水稻品种9311A在5个不同时间点的转录组测序数据比对到参考基因组JY-521获得的reads Table 1 Statistics of the total reads and reads mapped to the JY-521 reference genome in 9311A rice cultivar infected by T. horrida at five different time points 项目 Item 过滤读段数目 Number of clean reads Q20 (%) Q30 (%) GC (%) 唯一比对读段 Unique mapped reads (%) 比对率 Mapping ratio (%) 过滤后高质量数据High quality clean data (bp) 0 h 35664084 96.71 93.22 53.82 72.59 73.70 4419270750 8 h 32349250 96.86 93.50 54.67 71.13 72.21 4010609000 12 h 34438290 96.51 92.83 54.73 71.12 72.18 4261324500 24 h 34058782 96.53 92.87 54.44 71.51 72.61 4216792000 48 h 34542034 96.76 93.31 54.85 69.10 70.16 4278541000 72 h 31571784 96.78 93.35 54.27 70.38 71.40 3913244000 Total 202624114 25099781250 注:Q20, 测序错误率小于1%的序列百分比; Q30, 测序错误率小于0.1%的序列百分比; GC, 鸟嘌呤和胞嘧啶含量。 Note: Q20, percentage of sequences with sequencing error rates < 1%; Q30, percentage of sequences with sequencing error rates < 0.1%; GC, guanine and cytosine.

表1 稻粒黑粉病菌接种水稻品种9311A在5个不同时间点的转录组测序数据比对到参考基因组JY-521获得的reads Table 1 Statistics of the total reads and reads mapped to the JY-521 reference genome in 9311A rice cultivar infected by T. horrida at five different time points

与不侵染对照相比, 稻粒黑粉菌侵染8 h时显著上调基因120个, 显著下调基因217个; 12 h显著上调基因62个, 显著下调基因49个; 24 h显著上调基因29个, 显著下调基因62个; 48 h上调显著差异基因64个, 下调显著差异基因25个; 72 h上调显著差异基因32个, 下调显著差异基因23个(图1A)。在上调显著差异基因和下调显著差异基因中, 5个时间点均不存在持续上调和持续下调的基因(图1B, C), 其中大部分显著差异基因集中在稻粒黑粉病菌侵染8 h, 本研究推测8 h可能是稻粒黑粉病菌侵染的关键时间点。

图1

Fig.1

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	图1 稻粒黑粉病菌在5个不同侵染时间点的遗传统计 A: 5个侵染时间点差异表达基因统计Different expression genes statistics at five inoculation time points; B:韦恩图展示5个时间点上调基因的交集Venn diagram of up-regulated genes at five inoculation time points; C:韦恩图展示5个时间点下调基因的交集Venn diagram of down-regulated genes at five inoculation time points.Fig.1 Genetic statistics of five different infection time points of kernel smut

植物真菌的致病反应是由多个基因共同调控的复杂生物学过程^[18], 具有相同表达模式的基因可能在同一生物学过程中发挥功能。本研究对5个侵染时间点的500个DEGs进行了聚类分析, 结果表明, 基于其表达模式划分为24个表达模块(图2)。其中在侵染8 h表达量下调的模块(profile6、profile2和profile3)、持续下调表达的模块(profile0)和持续上调表达的模块(profile23)基因数最多。呈持续上调表达模块(profile23)内共有33个DEGs(表2), 包括编码转录因子ACEII、假定自噬性囊泡破裂蛋白atg22、糖基转移酶家族1蛋白、甲基转移酶11型、糖苷水解酶家族18蛋白和CHRD超家族蛋白等与致病性相关蛋白编码基因。呈持续下调表达模块(profile0)内共有36个DEGs(表3), 分别编码假定类固醇5α -还原酶、RTA1样蛋白、多药转运蛋白、 MFS普通基质转运蛋白、短链黄醇脱氢/还原酶SDR、LRR蛋白、小寡肽转运蛋白、WD40重复基序蛋白、甲基转移酶、脱氧核糖二嘧啶光裂合酶、热激蛋白9、谷胱苷肽S-转移酶和MEF2-翻译延伸因子。

图2

Fig.2

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	图2 稻粒黑粉病菌中共表达差异基因的表达模块 模块顺序根据基因的数量排序。Fig.2 Clusters of genes with unique expression patterns in kernel smut of rice Clusters were ordered according to the number of genes assigned to them.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 profile23中持续上调表达基因 Table 2 Sustained up-regulated genes in profile23

表2 profile23中持续上调表达基因 Table 2 Sustained up-regulated genes in profile23

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 Profile0中持续下调表达基因 Table 3 Sustained down-regulated genes in profile0

表3 Profile0中持续下调表达基因 Table 3 Sustained down-regulated genes in profile0

将筛选阈值定为corrected P-value≤ 0.05, 对不同时间获得的差异表达基因进行GO注释分析(图3), 这些DEGs被富集注释到3个GO分类, 分别是生物学过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)。以未侵染为对照, 对稻粒黑粉菌侵染8 h显著差异表达基因进行GO富集分析, 结果显示, 上调DEGs在生物学过程分类中的生长、细胞组成分类中的细胞器组件和分子功能分类中的酶调节活性、分子功能调节显著富集。显著下调DEGs在生物学过程的代谢过程和分子功能的结合、催化活性显著富集。推测该7条富集条目可能与稻粒黑粉病菌致病途径相关。

图3

Fig.3

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图3 稻粒黑粉病菌侵染8 h的DEGs的GO富集分析 1:生长Growth; 2:定位Localization; 3:生殖Reproduction; 4:应激Response to stimulus; 5:单生物过程Single-organism process; 6:信号Signaling; 7:生物调控Biological regulation; 8:代谢过程Metabolic process; 9:细胞成分组织或生物发生Cellular component organization or biogenesis; 10:细胞进程Cellular process; 11:核苷酸结合转录因子活性Nucleic acid binding transcription factor activity; 12:转运器活性Transporter activity; 13:催化活性Catalytic activity; 14:分子传感器Molecular transducer activity; 15:酶调节器活性Enzyme regulator activity; 16:分子功能调节器Molecular function regulator; 17:结合Binding; 18:细胞膜Membrane; 19:细胞膜组件Membrane part; 20:细胞器Organelle; 21:大分子复合物Macromolecular complex; 22:细胞器组件Organelle part; 23:细胞Cell; 24:细胞组件Cell part.Fig.3 DEGs in T. horrida at 8 h of infection by GO enrichment analysis

对DEGs进行KEGG富集分析表明, 脂肪酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、过氧化物酶体(peroxisome)、脂肪酸降解、类固醇合成、脂肪酸生物合成和淀粉与蔗糖代谢显著富集, 这些代谢途径很可能参与了稻粒黑粉病菌对水稻粒致病过程(图4)。

图4

Fig.4

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	图4 稻粒黑粉病菌侵染8 h的DEGs显著生物合成途径的KEGG富集分析Fig.4 The enriched biosynthetic pathways of DEGs in T. horrida at 8 h by KEGG enrichment analysis

病原性真菌分泌的碳水化合物活性酶可通过降解植物细胞壁使病原菌成功侵染寄主^[19]。5个侵染时间点发现55个与碳水化合物酶相关的上调表达DEGs(图5), 其中8 h显著上调DEGs有31个, 12 h显著上调DEGs有20个, 24 h显著上调DEGs有34个, 48 h显著上调DEGs有38个, 72 h显著上调DEGs有39个。其中MFS转运蛋白[major facilitator superfamily (MFS) transporter]编码基因smut_0187和smut_4884、角质酶(cutinase)编码基因smut_3124以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)编码基因smut_4358分别在侵染8、12和48 h上调表达。有研究发现, MFS转运蛋白、角质酶以及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在真菌致病过程中起关键作用^{[20, 21, 22]}, 表明smut_0187、smut_4884、smut_3124和smut_4358可能参与稻粒黑粉病菌致病机制。

图5

Fig.5

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	图5 病原相关基因在碳水化合物活性酶中的表达模式Fig.5 Expression pattern of pathogenic related genes in carbohydrate-active enzyme

真菌分泌蛋白大多与无毒基因相关, 且在宿主植物的致病性过程中起重要作用。在真菌侵染宿主植物过程中, 分泌蛋白能与宿主植物细胞进行信号交换, 引起一系列生理生化反应^[23]。在稻粒黑粉病菌侵染8 h有34个分泌蛋白相关DEGs, 其中20个上调表达, 14个下调表达(图6), 这些基因可能与稻粒黑粉病菌的致病途径相关。其中乙二醛氧化酶(glyoxal oxidase, GLX)编码基因smut_4820在侵染8 h显著上调, 相关报道发现, GLX在真菌侵染宿主细胞时能降解植物细胞壁^[24], 表明smut_4820可能参与稻粒黑粉病菌定殖稻穗过程。

图6

Fig.6

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	图6 病原相关基因在分泌蛋白中的表达模式Fig.6 Expression pattern of pathogenic related genes in secreted protein

在稻粒黑粉病菌侵染的不同时间点, 检测到59个寄主-病原互作(pathogen-host interactions, PHIs)上调DEGs, 包括乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase-like protein)编码基因smut_0340和smut_6327、PMA1-H⁺转运P型ATPase(PMA1-H⁺-transporting P-type ATPase)编码基因smut_0538、自噬相关蛋白(autophagy-related protein 12)编码基因smut_1077、转录因子ACEII(transcription factor ACEII)编码基因smut_1130、O-甲基转移酶(O-methyltransferase)编码基因smut_1293、糖苷水解酶家族蛋白(glycoside hydrolase family 18 protein)编码基因smut_1649, WD40重复蛋白(WD40 repeat-like protein)编码基因smut_3965, 几丁质酶(chitinase)编码基因smut_3971, GMC氧化还原酶(GMC oxidoreductase)编码基因smut_3977, 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因smut_4358, S-腺苷-L-蛋氨酸依赖性甲基转移酶(S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase)编码基因smut_4881, 糖苷水解酶家族蛋白(glycoside hydrolase family 5 protein)编码基因smut_5678(图7)。相关报道表明, 稻瘟病菌P-ATPase基因MoCTA3在稻瘟病菌侵染水稻72 h时表达量上调, 其在稻瘟病菌致病过程中起重要作用^[25]; 此外, 自噬相关蛋白、几丁质酶、糖苷水解酶家族蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和氧化还原酶均参与了真菌的致病性生物学过程^{[5, 26, 27, 28]}。

图7

Fig.7

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	图7 病原相关基因在病原体-宿主相互作用中的表达模式Fig.7 Expression pattern of pathogenic related genes in pathogen-host interactions