供试柳枝稷 Alamo品种的成熟种子购于美国 Ernst Conservation Seeds 公司。

选取柳枝稷种子, 在70%酒精中浸泡2 min 后, 将种子放在灭菌液(成分:巴士消毒液20%, 灭菌水80%)中, 在150 r/min的摇床上, 室温, 30 min。种子灭完菌后用灭菌水洗净, 在超净工作台下吹干, 然后播在灭菌的营养土中, 并维持在(28± 2) ℃, 黑暗条件下培养。

参考水稻原生质体的提取方法^[26], 在此基础上优化条件, 使该方法适用于柳枝稷。原配方成分为酶解液, W5溶液, Mmg溶液和40% PEG溶液。具体的配方如下:酶解液为0.6 mol/L甘露醇(D-mannitol), 10 mmol/L MES [2-(N-吗啡啉)乙磺酸, pH 5.7], 1.5% 纤维素酶(Cellulase RS), 0.75%果胶酶(Macerozyme), 0.1% BSA(牛血清白蛋白), 3.4 mmol/L CaCl₂, 5 mmol/L β -羟基乙醇(β -mercaptoethanol)和50 μ g/mL羧苄青霉素(carbenicillin); W5溶液为154 mmol/L NaCl, 125 mmol/L CaCl₂, 5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES; Mmg溶液为0.6 mol/L甘露醇, 15 mmol/L MgCl₂和4 mmol/L MES; 40% PEG溶液为0.6 mol/L甘露醇, 100 mmol/L CaCl₂和40% PEG4000 (聚乙二醇4000)。

设计梯度实验, 确定柳枝稷原生质体分离的最佳条件, 每组梯度实验重复3次。具体方案如下:1)对植物培养的时间进行优化。 酶解时间固定在8 h, 甘露醇浓度为0.6 mol/L, 将培养了1, 2, 3和4周的黄化苗用作实验材料; 2)渗透压优化。 选取2周的黄化苗为实验材料, 酶解时间固定在8 h, 甘露醇浓度分别为0.4, 0.5, 0.6, 0.7和0.8 mol/L; 3)酶解时间优化。 选取2周的黄化苗为实验材料, 甘露醇浓度为0.6 mol/L, 酶解时间分别为6, 7, 8, 9和10 h。

首先使用全新的刀片将柳枝稷黄化幼苗的叶片切割成1 mm宽的细条。用镊子将切好的苗条放在含20 mL酶溶液的150 mL烧瓶中, 放置28 ℃的黑夜中振荡(40~60 r/min)培养, 4 h后从烧瓶中取10 μ L, 在显微镜下观察原生质体。健康的原生质体应是圆形的并没有其他细胞。酶解完成后, 原生质体及酶的混合液经35 μ m(100 μ m)的筛网, 除去未完全酶解的材料。滤液经916 r/min离心5 min, 去掉上清。向沉淀(原生质体)加入3 mL的W5溶液使其悬浮, 再向管底加入5 mL的CPW20溶液[附加20%蔗糖的CPW盐溶(细胞原生质体清洗液, cell protoplast wash medium)], 916 r/min离心4 min, 两相中间出现一条纯净的原生质体带, 小心取出并以W5溶液重悬后等到纯净的原生质体。取少量纯化后的原生质体悬浮液滴加在血球计数板上, 在显微镜下观察计数, 依次计数中央大方格内原生质体数, 重复3次。

原生质体的密度(个/mL)=大方格(0.1 mm³, 即0.1 μ L)的原生质体数× 10⁴

原生质体产量(个/g)=原生质体密度× 原生质体悬浮液总体积(mL)/制备原生质体所用材料的鲜重

选用pEZR(K)-LN双元载体用作亚细胞定位载体。该载体含CaMV 35S启动子和加强型的绿色荧光蛋白eGFP。OsMYB103基因是MYB家族的转录因子, 根据Yang等^[27]的方法, 将OsMYB103连接上LN载体 (pEZR-LN), 用于亚细胞定位的实验。

将制备好的原生质体冲悬浮于Mmg溶液中。取10 μ g的质粒LN-PCF5放入2 mL离心管, 再加入200 mL重悬液, 轻轻混匀后在室温下放置15 min, 接着加入220 μ L的 40% PEG溶液, 轻轻混匀, 室温放置 15 min。用 880 μ L的W5 溶液重新悬浮原生质体, 轻弹管底混匀, 1183 r/min离心 2 min, 弃上清液。加入1 mL WI溶液(即洗涤培养液, washing and incubation solution, 配方为0.5 mol/L 甘露醇, 20 mol/L KCl和4 mmol/L MES) 重悬浮并转移至经BSA(牛血清白蛋白)预冲洗过的培养皿中, 24 ℃过夜培养。之后用激光共聚焦显微镜(Leica, Germany)观察鉴定。

2.1.1 黄化苗培养时间 植物的幼嫩程度会极大地影响原生质体提取效率, 在此首先针对植物培养的时间进行优化。在保持渗透压和酶解时间不变的条件下, 选择不同培养时间的黄化苗进行原生质体的提取。如图1所示, 培养1周左右的黄化苗得到的数量较少, 且细胞也偏小, 不利于亚细胞定位的观察; 而培养2~3周的黄化苗能得到数量很多的原生质体, 并且2周左右的苗子能得到最多数量原生质体, 适用于亚细胞定位实验观察。而超过3周后的柳枝稷黄化幼苗, 提取原生质体的量开始减少。

图1

Fig.1

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	图1 不同时期的黄化苗提取柳枝稷原生质体 甘露醇浓度为0.6 mol/L, 酶解时间为8 h。 The concentration of mannitol: 0.6 mol/L; Enzymolysis time: 8 h. 不同小写字母表示差异显著(P< 0.05), 下同。Different lowercase letters mean significant difference (P< 0.05). The same below.Fig.1 The preparation of switchgrass protoplasts with different periods of etiolated seedlings

2.1.2 渗透压优化 植物细胞在缺少细胞壁的保护之后, 对外界的渗透压会非常敏感。因此, 渗透压的优化是原生质体提取的一个重要环节。选择2周大的黄化苗在保持酶解时间不变的条件下, 选择不同渗透压条件进行原生质体的提取。如图2所示, 当甘露醇浓度为0.4 mol/L时, 得到非常少量的原生质体, 随着浓度上升, 原生质体提取量迅速增大, 在甘露醇浓度为0.6 mol/L时原生质体提取量达到了最大值。之后随着甘露醇浓度的增大, 原生质体的量又迅速的减少。

图2

Fig.2

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	图2 不同渗透压下提取柳枝稷原生质体 2周的黄化苗, 酶解时间8 h。 Etiolated seedlings of two weeks, enzymolysis time: 8 h.Fig.2 The preparation of switchgrass protoplasts under different osmotic pressure

2.1.3 酶解时间优化 在黄化苗苗龄及渗透压一致的条件下, 酶解时间能明显影响原生质体的产量。如图3所示, 酶解7和8 h都能获得大量的原生质体, 并且8 h获得的原生质体数最多。在酶解6~8 h之间, 原生质体数量随着酶解时间增大而显著增加, 当大于酶解8 h时, 原生质体数量则随着酶解时间的增大而减小, 而且发现游离的细胞碎片明显增多。

图3

Fig.3

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	图3 不同酶解时间下提取原生质体 甘露醇0.6 mol/L, 2周的黄化苗。The concentration of mannitol: 0.6 mol/L, etiolated seedlings of two weeks.Fig.3 The preparation of switchgrass protoplasts in different enzymolysis time

综合分析影响柳枝稷叶肉原生质体制备的主要因素, 柳枝稷叶肉原生体质体系得以优化。选取2周大的柳枝稷黄化幼苗为实验材料, 酶解液中甘露醇浓度为0.6 mol/L, 酶解8 h。流程如下:对Alamo柳枝稷种子进行灭菌处理, 维持在(28± 2) ℃, 黑暗条件下培养2周, 取柳枝稷黄化幼苗的叶片切割成1 mm宽的细条, 将切好的苗条与酶解液充分接触(图4a), 对得到的原生质体进行沉淀纯化, 消除分离过程中的破裂细胞和未酶解的碎片, 获得原生质体(图4b)。基于上述流程所得到的原生质体大, 碎片少, 量多, 活性强(图4c), 满足进一步的遗传转化实验条件。

图4

Fig.4

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	图4 柳枝稷原生质体的分离 a:样品的酶解反应The enzymatic hydrolysis of the sample; b:原生质体的沉淀纯化Purification of protoplasts; c:柳枝稷原生质体Protoplasts.Fig.4 Separation of switchgrass protoplasts

从水稻基因组数据库中(http://rice.plantbiology.msu.edu)下载OsMYB103(ID:Os08g05520)的基因序列。根据序列信息LN载体的引物LN-EcoRI-103: AGCTCAAGCTTCGAATTCATGGGGCATCACTCTTGCTGC; LN-BamHI-103: AGCGGCAGCAGCCGGATCCTTAATCATGGTCATTTGGTCCCATA, 用高保真酶进行扩增, 其长度约为1000 bp。将扩增片段连上载体pEASY-T5(CT501, 全式金), 通过热激导入到菌株为BH5a的感受态大肠杆菌中(CD-201, 全式金), 之后挑菌测序。将携带正确质粒的大肠杆菌扩繁, 提取pEASY-103质粒, 用NEB公司的酶切体系, 分别对pEASY-103和LN载体进行双酶切。结果如图5a, pEASY-103酶切后有个1000 bp的片段, 这是目标基因OsMYB103, LN载体酶切后为10 kb以上的片段(图5b), 分别将这两段切胶回收, 再利用NEB公司的连接酶进行反应, 得到LN-103(LN-OsMYB103), 之后导入感受态大肠杆菌, 挑选阳性克隆测序。经酶切与测序检测, 质粒LN-103完全正确(图5c)。

图5

Fig.5

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图5 载体PCR扩增 MYB指的是含有MYB结构域的转录因子; LN指的是双元表达载体; marker为DL2000的marker; a:从植物cDNA中扩增得到的OsMYB103基因, 大小为1 kb左右; b:载体LN的双酶切胶图; c:LN-103(LN-OsMYB103)的双酶切图, 载体大小完全正确。MYB refers to the transcription factor; LN refers to the binary expression pEZR; marker:DL2000 marker; a:The OsMYB103 gene, which is about 1 kb in size, was amplified from cDNA; b: The double enzyme map of pEZR-LN; c:The double enzyme map of LN-103 and the pEZR size is correct.Fig.5 PCR amplification of pEZR

将制备好的柳枝稷原生质体分别和LN-103(LN-OsMYB103), LN空载体共培养12 h, 在共聚焦显微镜下进行检测。如图6所示, 在激发光为488 nm条件下LN-103和LN空载体都检测到了绿色荧光; 在激发光为580 nm下, 原生质体检测到了红色荧光。携带OsMYB103基因的质粒始终定位于细胞核上, 这与Yang等^[27]的实验结果一致。同时空载体LN的荧光蛋白在细胞、细胞核及细胞膜上。上述结果表明, LN载体适用于柳枝稷的亚细胞定位实验, 并且可用于转录因子等相关基因的分析。

图6

Fig.6

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	图6 携带OsMYB103基因的LN-103载体和LN空载体的亚细胞定位图(10 μ m)Fig.6 Subcellular localization of pEZRLN-103 and empty pEZR-LN carrying OsMYB103 gene (10 μ m)