当归育苗试验设在甘肃省定西市岷县禾驮乡石家台村大石沟大湾梁, 属高原型大陆性季风气候, 境内平均海拔2865 m, 年均气温5.5 ℃, 年均日照时长2214.9 h, 年均降水量800 mm, 无霜期123 d, 最热7月平均气温16 ℃, 最冷1月平均气温-6.9 ℃, 平均相对湿度68%, 植被覆盖良好, 属典型高寒阴湿区, 高寒草甸土壤类型, 为当归传统道地育苗区和栽培产区。

当归生荒地(uncultivated fields, SH )和熟地黄芪茬口(cultivated residue of A. membranaceus, HQ)育苗试验地分别设在岷县禾驮乡石家台村大石沟大湾梁山顶和半山腰, 位于同一山脉, 均属温带大陆性季风气候, 但海拔高度、降水量和土壤及植被类型均有差异。山顶生荒地土壤类型为高寒草甸土壤, 半山腰熟地农田土壤类型为灰棕壤, 均适宜当归生长发育。当归育苗前对植被观察, 育苗期采用地温自动记录仪(RC-4HC Data Logger, 成都华恒仪器有限公司)对生荒地和熟地试验地中心地表10 cm 处温度自动记录(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 2016年9月18日至2017年9月17日岷县生荒地与熟地当归育苗田地表温度比较 Table 1 Comparison of annual soil surface temperatures in the uncultivated and cultivated fields for A. sinensis seedling cultivation in Min County, during September 18, 2017 to September 17, 2018 10 cm土层地表温度 Surface temperatures of 10 cm soil layers 生荒地 Uncultivated field 熟地 Cultivated field 纬度 Latitude N 34° 42'03″ N 34° 42'62″ 经度 Altitude E 104° 26'48″ E 104° 26'81″ 海拔 Altitude (m) 3200 2650 温度范围 Temperature range (℃) -9.70~26.50 -10.60~30.80 平均温度Average temperature (℃) 4.05± 8.07 7.38± 9.35 观察时间点数 Observation time points 1461 2177 95%年均温置信区间 The annual mean temperature 95% confidence interval 3.65~4.48 6.99~7.77

表1 2016年9月18日至2017年9月17日岷县生荒地与熟地当归育苗田地表温度比较 Table 1 Comparison of annual soil surface temperatures in the uncultivated and cultivated fields for A. sinensis seedling cultivation in Min County, during September 18, 2017 to September 17, 2018

育苗试验用当归种子为2016年在生荒地留苗地3年生当归种株采集的种子, 经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为当归, 挂凉保藏备用于生荒地和熟地黄芪茬当归育苗试验。

在岷县禾驮乡石家台村半山腰熟地农田2013-2014年当归繁种结束, 2015年种植豌豆品种陇豌2号匀田倒茬, 2016年采用种子播种蒙古黄芪(A. membranaceus var. mongholicus)育苗, 培育黄芪茬口, 以确保茬口土壤均匀一致。2017年当归播种育苗。黄芪茬口培育试验采用随机区组设计, 3次重复, 即在上年豌豆匀田基础上, 2016年4月10日将试验地按坡度划分为3个区组(3次重复), 小区面积4.8 m²(4.0 m× 1.2 m), 区组间隔0.5 m, 四周设地埂, 地埂宽0.5 m, 每小区施用有机肥1 kg(施用量2083.3 kg· hm^-2), 采用开沟条播法播种蒙古黄芪种子, 播深3 cm, 行距10 cm, 播种后耙平, 以培育黄芪茬口, 每小区种子播种量75 g(折合播量156.3 kg· hm^-2), 黄芪育苗期田间管理同大田。黄芪种苗采挖期2016年10月10日按小区用叉锨逐区采挖收获, 维持小区自然状态越冬, 对小区按坡度走向分别编号黄芪茬(HQ1、HQ2、HQ3), 备用于次年当归熟地育苗。

熟地黄芪茬口当归育苗试验于2017年6月1日在上述已培育的茬口进行, 按小区捡拾石砾及草根后, 每小区施有机肥2.5 kg, 用铁锨翻耕后耙平, 每小区当归种子播种量为25 g(折合播量52.0 kg· hm^-2), 采用撒播方法播种, 播种后覆盖麦草保墒增温, 覆盖厚度以遮住土壤为宜。

生荒地当归育苗试验于2017年6月1日开挖草皮后碎土捡拾草根, 用铁锨翻耕后耙平, 育苗方法与熟地育苗方法一致, 采用随机区组设计, 3次重复, 即按坡度走向划分为3个区组(3次重复), 除生境不同外, 小区面积、每小区施用有机肥量、当归种子播种量、播种育苗方法均与熟地黄芪茬口完全一致。

上述生荒地和熟地黄芪茬口当归育苗期均不施除草剂和农药, 其他农事田间管理均与大田一致。

当归育苗结束, 2017年10月7日田间采挖种苗时对生荒地和熟地黄芪茬3个重复小区分别随机取样20苗, 每处理共取样60苗, 立即拌鲜土放至采样箱内低温带回实验室, 备用于病株统计和抗逆生理指标测定。其余种苗拌鲜土扎把越冬贮藏, 备用于次年成药栽培期返青成活率和早期抽薹率的测定。

当归种苗细胞膜稳态性按照Guo等^[19]的方法以测定相对电导率和氨基酸泄漏率衡量, 渗透调节能力以测定可溶性糖和可溶性蛋白质含量衡量。当归种苗脂质过氧化程度以测定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和组织自动氧化速率(autoxidation rate, AR)衡量。AR测定5 h后的丙二醛含量, 以每小时MDA含量的平均增加量来表示组织自动氧化速率, 用于衡量活性氧自由基(reactive oxide species, ROS)对细胞的氧化攻击程度^{[18, 19]}。采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)光化还原法测定超氧物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性, 采用愈创木酚显色法测定过氧化物酶(peroxidase, POD)活性, 采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(catalase, CAT)活性, 测定在240 nm处每分钟光密度的变化量^{[18, 19]}。上述指标每重复小区测定3次, 每处理共测定9次。

种苗返青结束按重复小区依次统计返青成活株数和早期抽薹株数, 最后分别计算返青率和早期抽薹率。

返青成活率(regreen-survival rate)=(移栽后返青成活株数/移栽总株数)× 100%

早期抽薹率(early-bolting rate)=(早期抽薹株数/返青总株数)× 100%

采用Excel 2003进行处理平均数间的t检验并制图。

岷县禾驮乡石家台村大石沟大湾梁生荒地和熟地生境差异较大, 生荒地地势陡险(坡度30° ), 植被覆盖度好, 半山腰熟地农田以农作物为主, 地势较为平缓(坡度20° )。尽管生境有一定差异, 但生荒地和熟地农田四周地埂均以艾草(Artemisia argyi)为优势种。图1显示, 山顶生荒地当归育苗区属典型高寒草甸植被, 以草本植物为优势种群, 种群结构复杂, 物种多样性丰富, 与处于同一山脉半山腰的熟地农田豌豆轮作黄芪育苗地具有明显差异, 熟地豌豆茬口黄芪育苗田由于定期杂草管理, 植物种群结构单一, 黄芪优势种生态位突出。由于生荒地大气湿度大, 当归种子播种后较熟地出苗率高, 群体长势良好, 但熟地种苗个体生长优势较强, 在2017年极端干旱条件下也获得一定数量的当归种苗(图1)。

图1

Fig.1

Figure Option ViewDownloadNew Window

图1 岷县生荒地和熟地豌豆-黄芪茬口培育田植被特征及当归苗长势 A: 生荒地植被 Vegetation in wild uncultivated field; B: 熟地当归轮作豌豆后黄芪育苗长势Growth state of A. membranaceus seedlings based on rotating pea following A. sinensis in the cultivated agricultural field; C: 生荒地当归育苗长势Growth state of A. sinensis seedlings in the wild uncultivated field; D: 豌豆-黄芪轮作茬口当归育苗长势Growth state of A. sinensis seedlings in the pea-Astragalus rotation field.Fig.1 Vegetation characteristics of uncultivated field and pea-Astragalus cultivated seedling field as well as growth state of A. sinensis seedlings cultured in Min County

生荒地和熟地豌豆-黄芪茬育成当归种苗根系相对电导率和氨基酸泄漏率虽均具有一定差异, 但差异性均未达到显著水平(P> 0.05), 黄芪茬育成当归种苗相对电导率更低(图2)。然而, 在生荒地育成的当归种苗根系氨基酸泄露率更低。熟地黄芪茬较生荒地育成当归种苗根系相对电导率下降15.29%(t=0.926, P> 0.05), 但氨基酸泄露率提高9.92%(t=1.518, P> 0.05)。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 生荒地和熟地育成当归种苗根系抗逆生理指标比较 HQ:熟地黄芪茬口Cultivated residue of A. membranaceus; SH:生荒地Uncultivated fields; 相同小写字母表示处理间差异未达到0.05显著水平。下同。The same small letters indicate no significant difference at 0.05 level. The same below.Fig.2 Comparison of root physiological stress indicators in A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields

生荒地和熟地黄芪茬育成当归种苗根系可溶性糖含量和可溶性蛋白质含量虽有一定差异, 但差异性也未达到显著水平(P> 0.05), 黄芪茬育成当归种苗可溶性糖含量与生荒地育成种苗的水平基本一致, 但可溶性蛋白质含量低于生荒地的水平, 说明黄芪茬熟地与生荒地育成当归种苗糖类渗透调节能力一致, 但蛋白质渗透调节能力稍有差异。生荒地育成种苗的蛋白质渗透调节能力更强。与生荒地育成种苗相比较, 熟地黄芪茬育成当归种苗可溶性糖含量仅提高0.44%(t=0.040, P> 0.05), 但可溶性蛋白质含量却下降23.68%(t=1.240, P> 0.05)(图2)。

熟地黄芪茬育成当归种苗根系丙二醛含量和根系组织自动氧化速率均较生荒地育成种苗的水平提高, 但两者差异性不显著(P> 0.05), 黄芪茬与生荒地育成当归种苗MDA含量水平差异性很小, 但生荒地种苗AR较低, 说明熟地育成当归种苗与生荒地育成当归种苗根系膜脂质抗氧化能力略有差异, 生荒地育成种苗的抗氧化能力更强, 使根系MDA含量处于较低水平(图3)。与生荒地育成种苗相比较, 黄芪茬熟地育成当归种苗MDA含量仅提高2.06%(t=0.478, P> 0.05), 而根系AR提高75.67%, 但因熟地区组间变异程度大, 变异系数48.14%, 使两者差异性未达到显著水平(t=1.542, P> 0.05)。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 生荒地和熟地育成当归种苗丙二醛含量和自动氧化速率的比较Fig.3 Comparison of MDA and AR in A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields

不同生境条件下育苗对当归苗根系抗氧化酶活性具有一定影响(图4)。熟地黄芪茬口条件下培育的当归种苗根系SOD和POD活性均较强, CAT活性较弱, 但与生荒相育成种苗间的差异性均不显著(P> 0.05), 熟地育成当归种苗根系SOD活性较生荒地的水平提高7.15%(t=0.909, P> 0.05), POD活性提高33.96%(t=0.601, P> 0.05), CAT活性却降低16.92%(t=0.903, P> 0.05)。熟地育成种苗个体差异性较大, 抗氧化酶类活性重复小区间的变异度均大于生荒地育成种苗的水平。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 生荒地和熟地育成当归种苗根系抗氧化酶类活性的比较Fig.4 Comparison of antioxidant enzymatic activities in A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields

不同生境条件下育成当归种苗越冬后种苗根部发病率均在25%~35%(图5)。黄芪茬口熟地条件下培育的当归种苗根部病害发病率相对较低, 较生荒相育成种苗下降10.71%(t=0.802, P> 0.05), 病情指数下降25.00%(t=1.375, P> 0.05), 但各小区种苗发病株数差异性较大, 导致小区间变异度大, 降低了不同来源差异显著性。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 生荒地和熟地育成当归种苗根病率和病情指数的比较Fig.5 Comparison of root disease rate and disease index in A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields

不同土壤条件下育成当归种苗春季移栽成药栽培返青成活率和返青株早期抽薹率的变化动态差异均不显著(图6)。黄芪茬口熟地培育的当归种苗移栽后返青势强, 至返青结束返青率始终高于生荒地种苗的水平, 终返青率较生荒地育成种苗增加3.13%(t=0.402, P> 0.05), 但返青株早期抽薹率却有所提高, 平均早期抽薹率较生荒地种苗的水平提高5.32%(t=0.869, P> 0.05), 但各小区返青株中早期抽薹率差异性大, 导致小区间变异度较大, 两者差异性未达到显著水平。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 生荒地和熟地育成当归种苗返青成活率和早期抽薹率的比较Fig.6 Comparison of regreen-survival rate and early-bolting rate in A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields

种苗返青成活率与其根系CAT呈正相关, 与POD活性的正相关达到显著水平(P< 0.05), 与SOD活性的正相关达到极显著水平(P< 0.01), 说明种苗抗氧化酶类活性的增强可提高当归种苗返青成活率, SOD作用更大, POD次之, CAT相对较弱。早期抽薹率与返青率呈极显著正相关(P< 0.01), 与抗氧化酶活性也均呈正相关, 相关程度依次为POD> SOD> CAT, 与POD和SOD间的正相关性达到显著水平(P< 0.05)。种苗丙二醛含量与组织自动氧化速率呈极显著正相关(P< 0.01), MDA含量愈高, AR越大, 对种苗返青及生长发育越不利(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 生荒地和熟地育成当归种苗抗逆生化指标与返青率和早期抽薹率的相关性分析 Table 2 Relation of physicochemical stress resistant indicators to the regreen rate and early-bolting rate of A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields 性状指标 Indicators X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X2-氨基酸泄漏率 Amino acid leakage rate 0.172 X3-可溶性糖含量 Soluble sugar content -0.127 -0.089 X4-可溶性蛋白质含量 Soluble protein content 0.000 -0.120 -0.113 X5- 丙二醛 MDA -0.253 -0.023 -0.136 -0.432 X6- 组织自动氧化速率 AR -0.183 0.251 -0.421 0.124 0.649* * X7-超氧化物歧化酶活性 SOD acitivity -0.086 0.357 0.008 -0.140 -0.210 -0.134 X8-过氧化物酶活性 POD acitivity 0.026 -0.034 0.217 -0.242 -0.062 -0.126 0.344 X9-过氧化氢酶活性 CAT acitivity 0.182 -0.418 0.039 0.009 -0.053 -0.290 0.099 0.085 X10-返青率 Regreen-survival rate 0.104 0.023 0.081 -0.337 -0.131 -0.321 0.688* * 0.499* 0.321 X11-早期抽薹率 Early-bolting rate -0.100 -0.190 -0.337 -0.316 0.014 -0.065 0.490* 0.496* 0.270 0.606* * 注: X1, 相对电导率。* * 表示相关性达极显著水平(P< 0.01), * 表示相关性达显著水平(P< 0.05), n=18, R16, 0.05=0.468, R16, 0.01=0.590。 Note: X1, relative conductivity. * * means great significant correlation at P< 0.01, * means significant correlation at P< 0.05, n=18, R16, 0.05=0.468, R16, 0.01=0.590.

表2 生荒地和熟地育成当归种苗抗逆生化指标与返青率和早期抽薹率的相关性分析 Table 2 Relation of physicochemical stress resistant indicators to the regreen rate and early-bolting rate of A. sinensis seedlings from the uncultivated and cultivated fields

相对电导率和氨基酸泄露率是衡量植物膜系统完整性的重要指标, 细胞膜稳态性差, 膜系统易被氧化损伤, 引起电解质泄露, 相对电导率增大^{[18, 19]}。蛋白质的不稳定性可使氨基酸泄漏率增加^[14]。植物在逆境下产生的大量活性氧自由基会引起膜脂质过氧化, 进而损伤膜系统, MDA是膜脂过氧化的最终产物, 浓度过高有毒害作用, 但低浓度具有信号诱导生物体增强抗逆性的功能, MDA含量与膜稳态性和蛋白质稳定性相结合可衡量植物抗逆性, 组织自动氧化速率是单位时间内MDA产生的速率, 可直接反映细胞膜脂质过氧化反应的程度^{[18, 19]}。本研究中, 当归种苗组织自动氧化速率与MDA含量呈极显著正相关进一步说明了两者在抗逆性评价体系中的内在联系, 生荒地育成当归苗蛋白质的稳定性更强, 而熟地育成当归苗膜系统稳态性更佳, 因为生荒地育成苗根系氨基酸泄漏率和组织自动氧化速率略低, 而熟地育成苗根系相对电导率和MDA含量略低, 说明不同来源当归种苗抗逆生理机制可能存在一定差异。2017年6-10月育苗期间降水不均匀, 在6-7月正值当归播种出苗期干旱少雨, 但育苗后期降水多, 可能导致熟地当归苗逆境压力势更大, 但种苗并没有受到严重伤害, 因为根系通过消耗可溶性蛋白质提高抗逆性, MDA处于较低浓度范围, 有利于激活其抗氧化系统机制, 才得以维持种苗生物膜系统的稳态性。

可溶性糖担负着渗透调节作用, 在植物旺盛光合作用期间通过渗透调节作用维护着细胞渗透势、细胞水分平衡和光合作用^[19]。一般植物的抗逆性与可溶性糖的大小呈正相关^[20]。极端逆境影响植物的生长发育, 可溶性蛋白作为保护性物质也参与植物细胞的渗透调节作用, 可溶性蛋白含量与植物的抗逆性呈正相关^{[21, 22]}。本研究表明, 豌豆-黄芪双豆间迎茬条件下当归种苗可溶性糖和可溶性蛋白含量均接近生荒地种苗的水平, 但可溶性糖较生荒地种苗提高0.11%, 可溶性蛋白质含量下降4.58%, 尽管差异性未达到显著水平, 但可说明在遇干旱气候条件下, 生荒地育苗对当归种苗有更适宜的环境优势, 环境压力较小, 也可说明熟地农茬口可造就环境压力势, 双豆茬轮作造就的环境压力势在一定程度上提高了当归种苗的渗透调节功能及生理调控保护作用, 从而有利于增强当归种苗的抗逆性。

生物自由基损伤理论证明当植物受到各种非生物因子胁迫时, 细胞内活性氧(ROS)包括超氧阴离子( O2·-)、过氧化氢、羟基自由基(· OH)和单线态氧(¹O₂)等积累过多, 其高度的氧化活性可破坏细胞膜结构, 使植物抗逆性下降, 导致植株发病甚至死亡, 抗逆植物体内可进化出高效抗氧化机制, 及时调控体内ROS以减轻这种氧化伤害^[18]。SOD主要将最具有毒性的 O2·-分解为H₂O₂和H₂O, H₂O₂进一步由POD和CAT协同清除^[19]。抗氧化系统发达的植株可抵抗氧化胁迫, 有效保护膜系统^{[21, 22]}。本研究中, 熟地豌豆-黄芪茬与生荒地育成当归种苗根系内MDA含量基本一致, 但抗氧化酶类活性存在一定差异。熟地育成种苗SOD和POD活性均高于生荒地种苗的水平, CAT活性却低于生荒地的水平, 尽管差异性未达到显著水平, 但也可以反映出熟地黄芪茬育苗环境对当归具有一定环境胁迫势, 因为CAT是抗逆性最弱的抗氧化酶类, 逆境条件下一般CAT最先受到影响, 易失活。尽管黄芪茬育成当归种苗CAT下降了16.92%, 但也维持了一定的CAT活性, 较生荒地种苗下降程度未达到显著水平, 这与金彦博等^[23]在岷县蚕豆(Vicia faba)-黄芪茬口基础上研究的结果相似, 进一步说明黄芪茬口培育的当归种苗可以增强SOD和POD维持根系的生物抗氧化功能。这从种苗返青成活率得到进一步解释, 即豌豆-黄芪茬口育成当归种苗较生荒地育成种苗早期抽薹率虽增加5.32%, 但返青成活率提高3.13%, 这可能是由于熟地育苗期间种苗受到干旱胁迫, 加速了种苗的自我繁殖保护能力的根源所在, 因为早期抽薹也是植物应对环境变迁的抗逆表现, 营养生长期的干旱胁迫可诱发当归物候的转变, 即从营养生长及早进入生殖生长, 完成生活史。抗氧化系统发达的种苗返青成活率和早期抽薹率均高的结果也证明了这一点。由于土壤是植物生长生存的环境, 植物可以改变土壤的生态环境, 进而影响后茬植物的生长发育。植物对茬口的适应也是一种抗逆表现^[24]。一般在田间最大持水量的60%范围内, 土壤含水量越高, 土壤微生物的活性愈强, 从而利于植物的生长发育^[25]。虽然当归重迎茬在土壤中积累了自毒物质, 豆科作物豌豆和黄芪均属于绿肥作物, 可能对降解当归自毒物质、促进种苗生长发育均具有重要作用。