苜蓿源miR168b跨界调控奶牛体内乳脂相关靶基因的筛选

doi:10.11686/cyxb2022449

摘要/Abstract

摘要：

筛选出高乳脂奶牛和低乳脂奶牛血液和牛奶中显著差异表达的苜蓿来源miRNAs及其在奶牛体内的潜在靶基因，可为进一步探究苜蓿源miRNAs（mtr-miRNAs）在基因水平调节牛奶乳脂率奠定基础。试验首先对生产4胎，日粮水平一致的荷斯坦奶牛牛奶进行了奶牛生产性能（dairy herd improvement， DHI）检测，在高乳脂和低乳脂奶牛中各选3头作为重复。运用RT-qPCR对奶牛血液和牛奶中的苜蓿源miRNAs进行定量，筛选出差异表达miRNAs后对其进行靶基因预测和分析，并根据miRNA-mRNA结合位点和定量结果筛选出与乳脂代谢相关的靶基因。结果如下：1）DHI检测筛选出了3头高乳脂奶牛和3头低乳脂奶牛，高乳脂奶牛牛奶中脂肪含量>4.2%，低乳脂奶牛牛奶中脂肪含量<3.5%；2）苜蓿源novel-miR54、miR156f、miR166a、miR168b和miR168c-3p在奶牛血液和牛奶中均能检测到，其中mtr-miR168b在高乳脂奶牛血液中的表达量极显著低于在低乳脂奶牛中的表达量（P<0.01），在高乳脂奶牛牛奶中的表达量显著低于在低乳脂奶牛中的表达量（P<0.05）；3）mtr-miR168b在乳腺上皮细胞中高表达抑制了其中脂代谢标志基因PPARγ，SCD1，CEBP/β和SREBP1的表达量；4）mtr-miR168b预测靶基因分别有1834和296个与GO和KEGG数据库比对成功，靶基因主要与N-聚糖生物合成（3.72%）、cGMP-PKG信号通路（2.37%）和血管平滑肌收缩（2.37%）密切相关，甘油磷脂代谢（1.69%）通路也被显著富集；5）筛选出CPT1A和STARD7两个与脂代谢密切相关的基因，并通过双荧光素酶报告确认了miR-168b和CPT1A与STARD7的靶向关系。由此可见，mtr-miR168b可抑制乳腺上皮细胞中的成脂标志基因的表达，试验为后续验证苜蓿源miRNAs调控奶牛乳脂率提供了可进一步验证的靶基因。

关键词: 荷斯坦奶牛, 跨界调控, mtr-miR168b, 乳脂, 靶基因

Abstract:

The alfalfa （Medicago sativa） miRNAs expressed significantly differently in the blood and milk of high-fat dairy cows and low-fat dairy cows and their potential target genes in dairy cows were screened out in order to lay a foundation for further exploring the regulation of milk fat level by alfalfa miRNAs at gene level. Firstly， the level of dairy herd improvement （DHI） was measured in milk of Holstein cows which had produced 4 fetuses and had the same dietary level. Three cows were selected from high-and low-milk-fat cows as duplicates and RT-qPCR was used to quantify alfalfa miRNAs in milk and blood of the dairy cows. After screening out differentially expressed miRNAs， the target genes were predicted and analyzed， and the target genes related to milk fat metabolism were screened according to the binding sites and quantitative results by miRNA-mRNA. The results were as follows： 1） Three high-fat dairy cows and three low-fat dairy cows were identified by their DHI score. The fat content in the milk of high-fat dairy cows was >4.2%， and that of low-fat dairy cows was <3.5%. 2） Alfalfa sourced novel-miR54， miR156f， miR166a， miR168b and miR168c-3p were detected in cow blood and milk. The expression level of miR168b in the blood of high-fat milk cows was extremely significantly lower than that in low-fat milk cows （P<0.01）， and similarly the expression level of miR168b in the milk of high-fat milk cows was significantly lower than that in low-fat milk cows （P<0.05）. 3） The high expression of mtr-miR168b in mammary epithelial cells inhibited the expression of adipogenic marker genes PPARγ， SCD1， CEBP/β and SREBP1. 4） GO and KEGG databases indicated 1834 and 296 target genes， respectively， predicted by mtr-miR168b. The predicted target genes were closely related to N-glycan biosynthesis （3.72%）， the cGMP-PKG signaling pathway （2.37%） and vascular smooth muscle contraction （2.37%） and the glycerophosphate metabolism pathway （1.69%） was also significantly enriched. 5） CPT1A and STARD7， two genes closely related to lipid metabolism， were also screened. A targeting relationship between miR-168b and CPT1A was confirmed by dual-luciferase report. In conclusion， mtr-miR168b can regulate milk fat production by inhibiting the expression of adipogenic marker genes in mammary epithelial cells， and this study identifies target genes for further verification of alfalfa miRNA regulation of milk fat percentage in dairy cows.

Key words: Holstein cow, cross-kingdom regulation, mtr-miR168b, milk fat, target gene

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图/表 15

表1 采样牛基本信息

Table 1 Basic information of sampling cattle

牛号 ID	产犊日期 Calving date （year/month/day）	胎次 Parity	产犊间隔 Calving interval （d）	泌乳天数 Lactation days （d）
0001	2021/7/19	4	371	120
0002	2021/7/12	4	340	127
0003	2021/5/13	4	364	187
0004	2021/7/12	4	426	127
0005	2021/5/15	4	381	185
0006	2021/7/31	4	364	108

表2 日粮组成及营养水平（干物质基础）

Table 2 The dietary composition and nutrient level （DM basis）

项目 Item	含量 Content	营养水平 Nutritient level	含量 Content
苜蓿 Alfalfa （%）	6.00	干物质采食量 Dry matter feed intake（kg·d^-1）	24.4
玉米青贮 Corn silage （%）	50.00	粗蛋白 Crude protein （CP， %）	17.2
全棉籽 Cottonseed （%）	1.00	中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber （NDF， %）	27.5
甜菜颗粒 Beet granules （%）	1.60	粗脂肪 Fat （%）	3.9
湿啤酒糟 Wet beer lees （%）	10.00	酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber （ADF， %）	21.7
压片玉米 Tablet corn （%）	4.00	牛奶净能Milk net energy production （NEL， MJ·kg^-1）	7.78
预混料 Premix （%）	26.96	淀粉 Starch （%）	27.5
水 H₂O （%）	1.20	钙 Ca （%）	0.53
合计 Total （%）	100.00	磷 P （%）	0.36

表3 miRNAs引物信息

Table 3 Primer information of miRNAs

miRNAs名称miRNAs name	引物序列Primer sequence （5'-3'）
U6	F：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT
U6	R：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT
mtr-miR168b	F：CATGTGTCGCTTGGTGCAG
	R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
	RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCCCGAC
mtr-miR166a	F： CACAGTTCGGACCAGGCTT
	R： AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
	RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGGAATG
mtr-miR168c-3p	F： CATAGACCCGCCTTGCATC
	R： AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
	RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTCAGTT
mtr-miR156f	F： CCGTTGACAGAAGATAGAGAGCAC
	R： ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG
	RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGCTC
mtr-novel-miR54	F： CCAAGTCCTTGTGTTGCATCTC
	R： ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG
	RT： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGATG
bta-miR-16a	F： GCCCGTAGCAGCACGTAAAT
	R： TGTCGTGGAGTCGGCAAT
	RT： CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACCAA

表4 引物信息

Table 4 Primer information

基因名称 Gene name	引物序列 Primer sequence （5'-3'）
GAPDH	F： GGCATCGTGGAGGGACTTATG
GAPDH	R： GCCAGTGAGCTTCCCGTTGAG
PPARγ	F： AAAGGAGAGCCTGAACTTGGAG
PPARγ	R： TCTGAACTGTGCTGTGGCAA
SCD1	F： ACATTGATCCCCACCTGCAA
SCD1	R： AAACGTCATTCTGGAACGGC
CEBP/β	F： TGGTGAATAGTGCTGCCCAT
CEBP/β	R： GGTGGTAGTTGTGGAAGCCC
SREBP1	F： CAATGTGTGAGAAGGCCAGT
SREBP1	R：ACAAGGAGCAGGTCACACAG
SERINC1	F： TTGCGGCCGC CAAGCCAAGCGCATAAGT
SERINC1	R： CCTCGAGCCTGTAGGACAAGGCATC
STARD7	F： TTGCGGCCGC CGTTCTCGGTCCAAGCGTT
STARD7	R： CCTCGAGATGGGAGGCGGAGACTGA
CPT1A	F： TTGCGGCCGC CTTAAGGGACAAGCGATT
CPT1A	R： CCTCGAGCAGTCTGATGGAAGGGAA

表5 基于DHI检测的高乳脂与低乳脂奶牛的奶产量及奶品质

Table 5 Milk yield and quality of high-fat and low-fat dairy cows based on DHI detection

项目 Item	牛号 ID	产奶量 DMY （kg·cow^-1）	乳脂率 MFP （%）	乳蛋白率 MPP （%）	乳糖率 MLP （%）	总固形物 Total solids （%）
高乳脂组High-milk fat group	0001	44.7	4.66	2.77	5.78	14.62
	0002	43.8	4.50	3.30	4.32	13.44
	0003	34.9	4.27	4.21	5.21	15.21
低乳脂组Low-milk fat group	0004	33.0	3.42	3.23	5.38	13.32
	0005	31.2	3.32	3.78	5.59	13.88
	0006	29.8	3.27	3.72	4.79	13.19

图1 苜蓿源miRNAs在奶牛血液中相对表达量a：苜蓿源miRNAs在牛血液中的表达量；b：苜蓿源miRNAs在高乳脂和低乳脂奶牛血液中的表达差异。ID： 0001~ID：0006为牛号，下同。**P<0.01为显著性。a： Alfalfa miRNAs expression level in blood， b： Expression difference of alfalfa miRNAs in blood of high-milk fat and low-milk fat dairy cows. ID： 0001-ID：0006 indicate cows numbers， the same below. **P<0.01 was considered statistically significant.

Fig.1 Relative expression level of alfalfa miRNAs in bovine blood

图2 苜蓿源miRNAs在奶牛牛奶的相对表达量a：苜蓿源miRNAs在牛奶中的表达量；b：苜蓿源miRNAs在高乳脂和低乳脂奶牛牛奶中的表达差异。*P<0.05为显著性。a： Alfalfa miRNAs expression level in milk， b： Expression difference of alfalfa miRNAs in milk of high-milk fat and low-milk fat dairy cows. *P<0.05 was considered statistically significant.

Fig.2 Relative expression level of alfalfa miRNAs in milk

图3 氧化前后牛血液中内源性miRNA与外源性miRNA表达量检测+代表经过该处理或检测miRNA表达水平，-代表未经过该处理或未检测此种miRNA，**P<0.01为显著性。+ stands for the expression level of the treated or detected miRNA， - stands for the untreated or detected miRNA. **P<0.01 was considered statistically significant.

Fig.3 The expression levels of endogenous and exogenous miRNA in bovine blood before and after oxidation

图4 mtr-miR168b高表达抑制奶牛BMEC乳脂的合成a： miR168b过表达后在不同诱导时间的相对表达量；b~e： miR168b高表达后BMEC中脂代谢相关基因定量。**P<0.01和*P<0.05为显著性。NC是mtr-miR168b mimics的阴性对照，是一段无义序列。 mimics为 mtr-miR168b mimics的序列模拟物，与mtr-miR168b的序列相同。a： Relative expression level of miR168b at different induction time after overexpression； b-e： Quantification of genes related to lipid metabolism in BMEC after high expression of mtr-miR168b. **P<0.01 and *P<0.05 was considered statistically significant. NC is negative control， which is the negative control of mtr-miR168b mimics， and it is a meaningless sequence. mimics is the sequence analog of mtr-miR168b mimics， which has the same sequence as mtr-miR168b.

Fig.4 High expression of mtr-miR168b inhibits the synthesis of milk fat in cow mammary epithelial cells

图5 mtr-miR168b在牛体内靶基因GO功能富集分析

Fig.5 Enrichment analysis of mtr-miR168b target gene GO function in cattle

图6 mtr-miR168b在牛体内靶基因KEGG通路富集分析

Fig.6 Enrichment analysis of mtr-miR168b target gene KEGG function in cow

表6 mtr-miR168b脂质代谢靶基因与组织表达评分

Table 6 mtr-miR168b lipid metabolism target gene and tissue expression score

靶基因

Target gene

与mtr-miR168b种子区域结合位点

Combine site with seed region of mtr-miR168b

表达组织（表达评分）

Expression organization （expression score）

CLN8

结合位点 Position： 1296

靶基因 Target gene --GCAAGCGG--

miRNA AAGGGCTGGACGTGGTTCGCT

牛奶 Milk（61.92）

乳腺脂肪 Breast fat（73.63）

CLN8

结合位点 Position： 1482

靶基因 Target gene --CCAAGCGA--

miRNA AAGGGCTGGACGTGGTTCGCT

牛奶 Milk（61.92）

乳腺脂肪 Breast fat（73.63）

SERINC1

结合位点 Position： 1559

靶基因 Target gene --CCAAGCGC--

miRNA AAGGGCTGGACGTGGTTCGCT

牛奶 Milk（96.08）

乳腺脂肪 Breast fat（97.83）

CPTP

结合位点 Position： 933

靶基因 Target gene --CCAAGCGT--

miRNA AAGGGCTGGACGTGGTTCGCT

牛奶 Milk（73.02）

乳腺脂肪 Breast fat（85.06）

乳腺Mammary gland（88.71）

STARD7

结合位点 Position： 1206

靶基因 Target gene --CCAAGCGT--

miRNA AAGGGCTGGACGTGGTTCGCT

牛奶 Milk（80.79）

乳腺脂肪 Breast fat（88.08）

乳腺 Mammary gland（90.56）

CPT1A

结合位点 Position： 2716

靶基因 Target gene --ACAAGCGA--

miRNA AAGGGCTGGACGTGGTTCGCT

牛奶 Milk（85.82）

乳腺脂肪 Breast fat（91.13）

乳腺 Mammary gland（75.98）

图7 转染后乳腺上皮细胞预测靶基因表达量a：mtr-miR168b表达量，b：预测脂代谢相关靶基因SERINC1、CPT1A和STARD7的表达量。**P<0.01为显著性。a： mtr-miR168b expression level， b： Predicting target gene SERINC1， CPT1A and STARD7 expression level which related to lipid metabolism. **P<0.01 was considered statistically significant.

Fig.7 Predicting target gene expression level of breast epithelial cells after transfection

图8 相对荧光素酶活性a，b为mtr-miR168b与构建的靶基因载体序列比对；c，d为相对荧光素酶活性。ns为无显著差异。**P<0.01为显著性。a， b is sequence comparison between mtr-miR168b and the constructed target gene vector； c， d is relative luciferase activity.ns indicate no difference. **P<0.01 was considered statistically significant.

Fig.8 Relative luciferase activity

图9 苜蓿源mtr-miR168b影响奶牛乳腺上皮细胞脂质代谢

Fig.9 Summary of pathway by which mtr-miR168b from alfalfa influences lipid metabolism in BMECs

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