基于纳米磁珠介导的狼尾草花粉管通道转化法体系的建立

doi:10.11686/cyxb2025047

草业学报 ›› 2025, Vol. 34 ›› Issue (12): 183-194.DOI: 10.11686/cyxb2025047

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基于纳米磁珠介导的狼尾草花粉管通道转化法体系的建立

王豫婉¹^,²(), 刘凌云³, 郭一荻³, 范希峰³, 岳跃森³, 穆娜³, 肖国增¹^,²(), 滕珂³()

^1.长江大学园艺园林学院，湖北荆州 434025
^2.长江大学香辛园艺植物种质创新与利用湖北省重点实验室，湖北荆州 434025
^3.北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所，北京 100097

收稿日期:2025-02-18 修回日期:2025-04-15 出版日期:2025-12-20 发布日期:2025-10-20
通讯作者: 肖国增,滕珂
作者简介:E-mail： tengke.123@163.com
E-mail： x_gz99@163.com
王豫婉（2001-），女，河南信阳人，在读硕士。E-mail： 1994820747@qq.com
基金资助:
北京市农林科学院创新能力建设专项(KJCX20250917);北京市农林科学院创新能力建设专项(KJCX20230119);北京市农林科学院创新能力建设专项(KJCX20251208);云南省科技计划(202403AP140045)

Efficient transformation of Pennisetum alopecuroides using pollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles

Yu-wan WANG¹^,²(), Ling-yun LIU³, Yi-di GUO³, Xi-feng FAN³, Yue-sen YUE³, Na MU³, Guo-zeng XIAO¹^,²(), Ke TENG³()

^1.The College of Horticulture and Garden，Yangtze University，Jingzhou 434025，China
^2.Hubei Key Laboratory of Spices & Horticultural Plant Germplasm Innovation & Utilization，Yangtze University，Jingzhou 434025，China
^3.Institute of Grassland，Flowers and Landscape Ecology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China

Received:2025-02-18 Revised:2025-04-15 Online:2025-12-20 Published:2025-10-20
Contact: Guo-zeng XIAO,Ke TENG

摘要/Abstract

摘要：

近年来纳米磁珠介导的遗传转化体系克服了传统转基因方法需组织培养再生的问题，能够缩短转基因植物培育周期，适用范围广泛。目前狼尾草尚未建立纳米磁珠介导的转化体系，且现有遗传转化体系尚不成熟。为建立纳米磁珠介导的狼尾草花粉转化体系，本研究以‘丽秋’狼尾草为材料，分析了‘丽秋’狼尾草花粉转染的最适温度和处理时间、纳米磁珠负载能力、杂交授粉和转基因株系筛选等纳米磁珠介导转化的关键环节。结果表明：与12、16和25 ℃处理相比，4和8 ℃下狼尾草花粉的活力较高。开孔转染时间0.5~2.0 h的花粉开孔率无显著差异，不同开孔转染时间下的花粉活力无显著差异，故选择了0.5 h为转染开孔时间。用转染后的花粉对‘丽秋’狼尾草进行授粉，随机挑选了自然结实获得的150粒种子。播种后利用80 mg·L^-1潮霉素进行筛选，之后经PCR检测和GFP荧光蛋白观察，获得了7株转基因植株。本研究建立了狼尾草纳米磁珠介导的花粉管通道转化法体系，5个月左右可以获得转基因苗，转化率达4.66%，为狼尾草遗传转化和分子改良提供了新的可行方案。

关键词: 狼尾草, 纳米磁珠, 花粉孔, 花粉磁转染, 转基因植株

Abstract:

In recent years， nanoparticle-mediated gene transformation has overcome the problem of traditional transgenic methods that require tissue regeneration and culture. This method shortens the cultivation cycle of transgenic plants， and has a wide range of applications. No mature genetic transformation systems are available forthe grass Pennisetum alopecuroides， so the aim of this study was to develop a nano-magnetic bead-mediated transformation system for this plant. The P. alopecuroides ‘Liqiu’ was used to optimize the key steps including transfection temperature and processing time， nanomagnetic bead loading capacity， and the hybridization and screening of transgenic lines. The results showed that the vitality of P. alopecuroides pollen was higher after treatments at 4 and 8 °C than after treatments at 12， 16， and 25 °C. There was no siginificant difference in the pollen opening rate between 0.5 and 2 hours of transfection time， and pollen vitality was not affected by the duration of the transfection time. Accordingly， 0.5 hours was selected as the transfection time. The transfected pollen was used to pollinate P. alopecuroides ‘Liqiu’， and 150 seeds were randomly selected from the naturally obtained hybrid seeds. Transgenic seedlings were screened on medium containing 80 mg·L^-1 hygromycin. Subsequently， PCR detection and green fluorescent protein observation results confirmed that seven transgenic plants had been obtained. In summary， a pollen tube channel transformation system based on DNA-coated nanomagnetic beads was established for P. alopecuroides. Our results show that transgenic seedlings can be generated within 5 months with a transformation rate of about 4.66%. This system represents a new solution for genetic transformation and molecular improvement of P. alopecuroides in the future.

Key words: Pennisetum alopecuroides, magnetic nanoparticles, pollen pore, pollen magnetofection, transgenic plant

王豫婉, 刘凌云, 郭一荻, 范希峰, 岳跃森, 穆娜, 肖国增, 滕珂. 基于纳米磁珠介导的狼尾草花粉管通道转化法体系的建立[J]. 草业学报, 2025, 34(12): 183-194.

Yu-wan WANG, Ling-yun LIU, Yi-di GUO, Xi-feng FAN, Yue-sen YUE, Na MU, Guo-zeng XIAO, Ke TENG. Efficient transformation of Pennisetum alopecuroides using pollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2025, 34(12): 183-194.

图/表 9

图1 ‘丽秋’狼尾草开花过程A：雌蕊柱头露出Pistil stigma exposed； B：雄蕊扬花散粉Stamens bloom and disperse powder； C：扬花后雄蕊退化Stamen degeneration after flowering.

Fig.1 The flowering process of P. alopecuroides ‘Liqiu’

图2 ‘丽秋’狼尾草花粉形态观察A：光学显微镜下花粉形态特征Pollen was observed under orthostatic optical microscope； B：扫描电镜下花粉形态观察Pollen was observed under scanning electron microscope （SEM）； C：未经过花粉开孔液处理的花粉孔状态Pollen pore status that has not been treated with pollen pore-opening solution； D：经过花粉开孔液处理的花粉孔状态Pollen pore status that has been treated with pollen pore-opening solution.

Fig.2 Pollen morphology observation of P. alopecuroides ‘Liqiu’

图3 纳米磁珠对质粒DNA的负载和保护能力A： MNP/DNA 复合物的琼脂糖凝胶电泳分析Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA and MNPs/DNA； B： MNP/ DNA 复合物酶切产物的琼脂糖凝胶电泳分析Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA and MNPs/DNA complexes digested with Xho Ⅰ； M： Trans 15K DNA Marker.

Fig.3 The loading and protective capabilities of magnetic nanoparticles for plasmid DNA

图4 ‘丽秋’狼尾草转染的最适温度A：转染缓冲液预处理后，将花粉粒转入发芽液中，在室温下培养3 h After pretreatment with transfection buffer， pollen grains were transferred into germinating media and incubated 3 h under RT （直立光学显微镜下观察花粉萌发情况Pollen germination was observed under orthostatic optical microscope）； B：未经预处理或在指定温度下预处理的花粉发芽情况Germination of pollen without pretreatment with transfection or pretreated under indicated temperatures； RT：室温Room temperature；不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著，下同Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level， the same below.

Fig.4 Optimal temperature for transfection of P. alopecuroides ‘Liqiu’

图5 ‘丽秋’狼尾草开孔转染的最适时间A： 8 ℃下不同时间转染缓冲液预处理的花粉电镜图像Scanning electron microscope （SEM） images of pollen pretreated with transfection buffer at 8 ℃ for different times； B：不同转染时间的狼尾草花粉开孔率Pollen opening rate after pretreatment in transfection buffer at different times； C：不同转染时间的狼尾草花粉活力Pollen viability after pretreatment in transfection buffer at different times.

Fig.5 Optimal time for transfection of P. alopecuroides ‘Liqiu’

图6 阳性植株验证A：潮霉素筛选‘丽秋’狼尾草转染的种子Hygromycin screening seeds transfected with P. alopecuroides ‘Liqiu’； B：阳性植物PCR检测结果PCR test results of positive plants； C： DNAMAN比对结果DNAMAN comparison results； M： Trans2K? Plus Ⅱ DNA Marker； WT：未转染植株Non-transfected plant.

Fig.6 Verification of positive plants

图7 pMDC85-GFP亚细胞定位结果

Fig.7 Subcellular localization of pMDC85-GFP

图8 激光共聚焦显微镜下的阳性植株根尖

Fig.8 The roots of positive transgenic plants under confocal microscope

图9 利用纳米磁珠负载DNA转染‘丽秋’狼尾草花粉的步骤

Fig.9 Steps in P. alopecuroides ‘Liqiu’ pollen transfection using DNA-coated magnetic nanoparticles

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Efficient transformation of Pennisetum alopecuroides using pollen transfected by DNA-coated magnetic nanoparticles

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