基于BSA-SSR技术的高丹草低氢氰酸性状目的片段的筛选与鉴定

doi:10.11686/cyxb2021016

摘要/Abstract

摘要：

采用BSA?SSR技术对高丹草低氢氰酸含量性状DNA目的片段进行了筛选和鉴定。结果表明，利用筛选出的9对SSR适宜引物PCR扩增找到了与高丹草低氰酸性状相关的SSR目的片段26个，经对PCR产物回收、部分纯化及测序分析，得到了这些低氰DNA片段的碱基序列。经与BLASTn数据库序列比对发现，有2个低氰目的片段TF8和TF16分别与高粱叶绿体磷酸核糖激酶XM_021458168.1和高粱克隆BAC 88M4 AY661656.1基因同源性高达95.4%和97.0%，其片段大小分别为101和586 bp。但在DNA碱基上有一定变异，TF8片段发生了3次碱基替换和1次插入，导致丙氨酸和甘氨酸替换成半胱氨酸，苏氨酸替换成丙氨酸，甘氨酸缺失；TF16片段缺失了1个碱基A，导致丙氨酸缺失。据此推测TF8和TF16这2个低氰目的片段具有调控低氢氰酸含量性状的作用。该研究结果为深入开展高丹草低氢氰酸含量性状主效QTL精细定位及标记辅助育种等研究奠定了基础。

关键词: 高丹草, 低氢氰酸含量性状, BSA-SSR技术, 目的片段筛选, 序列比对鉴定

Abstract:

In this study， bulk segregant analysis using simple sequence repeat markers （BSA-SSR） was used to screen and identify DNA fragments linked to low hydrocyanic acid content of sorghum-sudangrass hybrids. By PCR amplification using nine pairs of suitable SSR primers screened， 26 SSR target fragments related to low cyanide traits in sorghum-sudangrass hybrids were discovered. After PCR product recovery， partial purification， and sequence analysis， the base sequences of these DNA fragments linked to low cyanide content were obtained. Sequence comparison using the BLASTn database showed that two ‘low cyanide’ target fragments， TF8 （101 bp） and TF16 （586 bp） had， respectively， 95.4% and 97.0% homology with sorghum phosphoribulokinase chloroplastic gene XM_021458168.1 and sorghum clone BAC 88M4 gene AY661656.1， but there was no mention of hydrocyanic acid regulation in the functional annotation of these two genes. However， there are a number of variations in the DNA base sequences. The TF8 fragment has three base substitutions and one insertion， resulting in the replacement of an alanine and a glycine with cysteine， a threonine with alanine， and deletion of a glycine. Fragment TF16 has one base A missing， resulting in alanine deletion. Based on these results it is inferred that TF8 and TF16， two low cyanide target fragments， regulate the expression of a low hydrocyanic acid content trait. These results lay a foundation for further research on the detailed mapping and marker-assisted breeding of the major QTLs for low hydrocyanic acid content of sorghum-sudangrass hybrids.

Key words: sorghum-sudangrass hybrid, the trait of low hydrocyanic acid content, BSA-SSR, target fragment screening, sequence alignment identification

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图/表 12

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引物名称Primers	上游引物Forward primer （5′?3′）	下游引物Reverse primer （5′?3′）
AH99	CGCACCATTCCGTTCTTG	CCGACTGTGACGCACTTGAT
B4195	ACGACCACCGTCTCCAAC	CGCCTTCACCTGCTCATA
S64	YTTGCGACTAGCAAAGTGG	CGAACTCCTTGTACAGGATGG
Xtxp7	ACATCTACTACCCTCTCACC	ACACATCGAGACCAGTTG
Xtxp21	GAGCTGCCATAGATTTGGTCG	ACCTCGACCCACCTTTGTTG
Xtxp31	ACCCAAAGCCCAAATCAG	GGGGGAGAAACGGTGAG
Xtxp67	CCTGACGCTCGTGGCTACC	TCCACACAAGATTCAGGCTCC
Xtxp183	AAGTTGTAATGGGGCTATTG	TTAAGAGGTGGGATATTGGT
Xtxp321	TAACCCAAGCCTGAGCATAAGA	CCCATTCACATGAGACGAG

引物名称Primers	上游引物Forward primer （5′?3′）	下游引物Reverse primer （5′?3′）
AH99	CGCACCATTCCGTTCTTG	CCGACTGTGACGCACTTGAT
B4195	ACGACCACCGTCTCCAAC	CGCCTTCACCTGCTCATA
S64	YTTGCGACTAGCAAAGTGG	CGAACTCCTTGTACAGGATGG
Xtxp7	ACATCTACTACCCTCTCACC	ACACATCGAGACCAGTTG
Xtxp21	GAGCTGCCATAGATTTGGTCG	ACCTCGACCCACCTTTGTTG
Xtxp31	ACCCAAAGCCCAAATCAG	GGGGGAGAAACGGTGAG
Xtxp67	CCTGACGCTCGTGGCTACC	TCCACACAAGATTCAGGCTCC
Xtxp183	AAGTTGTAATGGGGCTATTG	TTAAGAGGTGGGATATTGGT
Xtxp321	TAACCCAAGCCTGAGCATAAGA	CCCATTCACATGAGACGAG

目的片段名称 Name of target fragment	引物名 Primer	片段大小 Size of fragment （bp）	目的片段名称 Name of target fragment	引物名 Primer	片段大小 Size of fragment （bp）
TF1	Xtxp7	300	TF14	Xtxp321	750
TF2	Xtxp7	280	TF15	Xtxp321	600
TF3	Xtxp7	240	TF16	Xtxp321	550
TF4	Xtxp31	600	TF17	S64	750
TF5	Xtxp31	350	TF18	S64	500
TF6	B4195	500	TF19	S64	600
TF7	B4195	300	TF20	S64	650
TF8	B4195	100	TF21	S64	420
TF9	Xtxp183	350	TF22	S64	400
TF10	Xtxp183	300	TF23	S64	450
TF11	Xtxp67	700	TF24	S64	350
TF12	Xtxp67	500	TF25	AH99	150
TF13	Xtxp67	300	TF26	Xtxp21	180

目的片段名称 Name of target fragment	引物名 Primer	片段大小 Size of fragment （bp）	目的片段名称 Name of target fragment	引物名 Primer	片段大小 Size of fragment （bp）
TF1	Xtxp7	300	TF14	Xtxp321	750
TF2	Xtxp7	280	TF15	Xtxp321	600
TF3	Xtxp7	240	TF16	Xtxp321	550
TF4	Xtxp31	600	TF17	S64	750
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TF6	B4195	500	TF19	S64	600
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TF11	Xtxp67	700	TF24	S64	350
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TF13	Xtxp67	300	TF26	Xtxp21	180

目的片段名称 Name of target fragment	片段实际大小 Size of fragment （bp）	目的片段名称 Name of target fragment	片段实际大小 Size of fragment （bp）	目的片段名称 Name of target fragment	片段实际大小 Size of fragment （bp）
TF1	282	TF10	277	TF19	585
TF2	271	TF11	618	TF20	589
TF3	235	TF12	447	TF21	363
TF4	451	TF13	56	TF22	344
TF5	353	TF14	622	TF23	504
TF6	476	TF15	501	TF24	297
TF7	241	TF16	586	TF25	136
TF8	101	TF17	672	TF26	403
TF9	314	TF18	560