党参黄芯病菌的鉴定及绿色荧光蛋白基因转化

doi:10.11686/cyxb2024480

草业学报 ›› 2025, Vol. 34 ›› Issue (11): 136-149.DOI: 10.11686/cyxb2024480

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党参黄芯病菌的鉴定及绿色荧光蛋白基因转化

付瑶¹^,²(), 王子贤¹^,², 陈泰祥³, 晋玲¹^,², 马晓辉¹^,², 王艳¹^,²()

^1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000
^2.西北中藏药省部共建协同创新中心，甘肃兰州 730000
^3.草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州 730020

收稿日期:2024-12-03 修回日期:2025-03-03 出版日期:2025-11-20 发布日期:2025-10-09
通讯作者: 王艳
作者简介:E-mail： gswangyan101@163.com
付瑶（2000-），女，山东青岛人，在读硕士。E-mail： a225265153@163.com
基金资助:
中药保障与创新能力提升项目(甘中医药综函〔2024〕14号);财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助(CARS-21);甘肃省科技计划项目(23ZDFA013-1);甘肃省自然科学基金(22JR5RA458);甘肃省2023年度优秀研究生“创新之星”(2023CXZX-762);西北中藏药省部共建协同创新中心开放基金项目(Xbzzy-2022-02)

Identification and green fluorescent protein gene transformation of the causal agent of yellow-core disease of Codonopsis pilosula

Yao FU¹^,²(), Zi-xian WANG¹^,², Tai-xiang CHEN³, Ling JIN¹^,², Xiao-hui MA¹^,², Yan WANG¹^,²()

^1.School of Pharmacy，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China
^2.Northwest Collaborative Innovation Center for Traditional Chinese Medicine Co-constructed by Gansu Province & MOE of PRC，Lanzhou 730000，China
^3.State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China

Received:2024-12-03 Revised:2025-03-03 Online:2025-11-20 Published:2025-10-09
Contact: Yan WANG

摘要/Abstract

摘要：

党参黄芯病降低党参的产量和质量，在明确该病病原菌分类地位的基础上，构建增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）标记的党参黄芯病菌转化株，为研究病原菌在党参植株体内的侵染特性提供可视化跟踪手段。基于形态学和多基因位点联合的方法，明确病原菌的分类地位。采用根癌农杆菌介导法（Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation， ATMT），将带有潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphotransferase， HygB）和增强型绿色荧光蛋白基因EGFP的双元载体转入党参黄芯病菌分生孢子中并筛选出遗传稳定的转化子。结果表明，党参黄芯病常年田间发病率为20%~30%。病原菌为弯镰孢菌党参变种，遗传转化共获得138株阳性转化子，转化效率约为46个转化子·10^-6个孢子。随机挑选的4株阳性转化子经6次继代培养，具有稳定的潮霉素B抗性和绿色荧光表达，其中转化子EGFP7-3与EGFP7-4生物学特性及致病性和野生型党参黄芯病菌无显著差异，表明绿色荧光蛋白基因已成功转入党参黄芯病菌中，转化子EGFP7-3与EGFP7-4稳定遗传且致病力不受影响。本研究为党参黄芯病菌致病机理的研究提供了良好的材料和技术支撑。

关键词: 党参, 黄芯病, 病原鉴定, EGFP, ATMT, 基因转化

Abstract:

Yellow-core disease of Codonopsis pilosula significantly reduces its yield and quality. First， we clarified the taxonomic position of the pathogen causing the disease， and developed EGFP-labeled transformants of the causative fungus， providing a means for visual tracking of infection characteristics within the host plants. The pathogen was clarified by using both morphological and multi-gene locus analyses. ATMT was used to introduce a binary vector carrying the HygB and EGFP into the conidia of the yellow-core disease fungus. Genetically stable transformants were screened. The results indicated that the field incidence of yellow-core disease is 20%-30%. The pathogen is identified as Fusarium curvatum var. codonopsidis. Genetic transformation produced 138 positive transformants at an efficiency of approximately 46 transformants per 10⁶ conidia. Four randomly selected positive transformants， after six subcultures， exhibited stable hygromycin B resistance and green fluorescence expression. Transformants EGFP7-3 and EGFP7-4 showed no significant differences in biological characteristics or pathogenicity compared to the wild-type strain， indicating successful and stableintegration EGFP without affecting virulence. This study provides valuable materials and technical support for investigating the pathogenesis and control of yellow-core disease in C.pilosula.

Key words: Codonopsispilosula, yellow-core disease, pathogen identification, EGFP, ATMT, gene transformation

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图/表 14

图1 pCAMBIA1303-gpdA-EGFP-TrpC-Hygro载体图谱

Fig.1 Restriction map of vector pCAMBIA1303-gpdA-EGFP-TrpC-Hygro

图2 党参黄芯病症状A：地上部分Aboveground part； B：地下部分Underground parts.

Fig.2 Symptoms of C. pilosula yellow-core disease

图3 DSHX2显微形态A~C： PDA、CLA和SNA上菌落形态Colonies on PDA， CLA and SNA media； D：大型分生孢子Macroconidia； E：小型分生孢子Microconidia； F：厚垣孢子Chlamydospores （标尺Scale bar=25 μm）.

Fig.3 Morphology of DSHX2

图4 F. curvatum var. codonopsidis DSHX2多基因联合系统发育树

Fig.4 Phylogenetic tree of F. curvatum var. codonopsidis DSHX2 based on multi-gene combination

图5 接种黄芯病病原菌后党参根系的发病症状A， E：无伤接种Noninvasive inoculation； B， F：刺伤接种Stab inoculation； C， G：无伤对照Noninvasive blank control； D， H：刺伤对照Stab control.

Fig.5 Symptoms in roots of C. pilosula after inoculation with yellow core disease pathogen

图6 阳性根癌农杆菌EGFP基因的PCR验证结果M： Marker； 1：蒸馏水，阴性对照Sterile water， negative control； 2： pCAMBIA1303-gpdA-EGFP-TrpC-Hygro，阳性对照Positive control； 3~12： EGFP农杆菌阳性转化子Transformed A. tumefaciens strains harboring EGFP.

Fig.6 PCR verification results of the positive A. tumefaciens EGFP gene

图7 不同浓度HygB对DSHX2的生长抑制情况A： 0 μg·mL-1 HygB； B： 25 μg·mL-1 HygB； C： 50 μg·mL-1 HygB； D： 100 μg·mL-1 HygB； E： 150 μg·mL-1 HygB； F： 200 μg·mL-1 HygB.

Fig.7 DSHX2 growth rate under different concentrations of hygromycin B

表1 农杆菌生长受头孢噻肟钠的抑制作用

Table 1 Agrobacterium growth rate under different concentrations of cefotaxime sodium

项目

Item

头孢噻肟钠浓度Mass concentration of cefotaxime sodium

农杆菌生长状况The growth state of LBA4404

图8 阳性转化子HygB稳定性和增强型绿色荧光表达A为含有100 μg·mL-1 HygB的PDA平板上4株转化子和DSHX2 Four transformants and DSHX2 grown on PDA supplemented with 100 μg·mL-1 hygromycin；B， C分别为4号转化子（EGFP7-4）荧光显微镜蓝色激发光下菌丝和分生孢子Mycelia and conidia of EGFP7-4， respectively， under blue excitation light microscopy （标尺Scale bar=50 μm）.

Fig.8 Stability of hygromycin-resistant transformants and enhanced green fluorescent protein expression

图9 转化子EGFP基因PCR验证M： DNA Marker； 1~4：转化子EGFP7-1~EGFP7-4 Transformants EGFP7-1-EGFP7-4； 5： pCAMBIA1303-gpdA-EGFP-TrpC-Hygro，阳性对照Positive control； 6： DSHX2，阴性对照Negative control.

Fig.9 PCR verification of EGFP gene of the transformants

图10 DSHX2与阳性转化子的菌落形态A： DSHX2；野生型菌株The wild type strain； B， C： EGFP7-3、EGFP7-4，阳性转化子Positive transformants.

Fig.10 The colony morphology of DSHX2 and positive transformants of F. curvatum var. codonopsidis

图11 野生子与转化子在PDA平板上的菌落直径不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Different lowercase letters mean significant difference at P<0.05 level.

Fig.11 Colony diameter of wild-type and positive transformants on PDA

图12 pH对野生子与转化子生长的影响

Fig.12 The growth of wild-type and transformants under different pH

图13 转化子EGFP7-3和EGFP7-4与野生子DSHX2致病性测定A， E： EGFP7-3； B， F： EGFP7-4； C， G： DSHX2； D， H：无菌水Sterile water.

Fig.13 Pathogenicity test of transformants EGFP7-3，EGFP7-4 and DSHX2

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党参黄芯病菌的鉴定及绿色荧光蛋白基因转化

Identification and green fluorescent protein gene transformation of the causal agent of yellow-core disease of Codonopsis pilosula

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