ISSN 1004-5759 CN 62-1105/S
Acta Prataculturae Sinica ›› 2026, Vol. 35 ›› Issue (7): 201-216.DOI: 10.11686/cyxb2025291
Wu LI1(
), Jia-jing LI1(), Jie-bing LI1, Zhen-zhou LI4, Ming GUO1,2,3, Yan NIU5, Hao SUN1,2,3, De-feng LI1,2,3, Ying-hua SHI1,2,3, Zhen-tian LI1,2,3, Bo-shuai LIU1,2,3, Ya-lei CUI1,2,3, Zhi-chang WANG1,2,3, Yong-tao LI4, Xiao-yan ZHU1,2,3()
Received:2025-07-14
Revised:2025-10-09
Online:2026-07-20
Published:2026-05-21
Contact:
Xiao-yan ZHU
Wu LI, Jia-jing LI, Jie-bing LI, Zhen-zhou LI, Ming GUO, Yan NIU, Hao SUN, De-feng LI, Ying-hua SHI, Zhen-tian LI, Bo-shuai LIU, Ya-lei CUI, Zhi-chang WANG, Yong-tao LI, Xiao-yan ZHU. Optimization of fermentation and ultrasound-assisted extraction parameters for alfalfa saponins[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2026, 35(7): 201-216.
Fig.1 Effects of strain type and fermentation time on alfalfa saponin yield
Fig.2 Effects of strain type and fermentation solid-to-liquid ratio on alfalfa saponin yield
Fig.3 Effects of strain type and inoculum volume on alfalfa saponin yield
Fig.4 Effects of strain type and glucose addition amount on alfalfa saponin yield
水平 Level | 发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 发酵时间 Fermentation time （B， h） | 菌添加量 Strain inoculum volume （C， mL） |
|---|---|---|---|
| -1 | 0.8 | 24 | 0.04 |
| 0 | 1.2 | 48 | 0.06 |
| 1 | 1.6 | 72 | 0.08 |
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design for fermentation process
水平 Level | 发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 发酵时间 Fermentation time （B， h） | 菌添加量 Strain inoculum volume （C， mL） |
|---|---|---|---|
| -1 | 0.8 | 24 | 0.04 |
| 0 | 1.2 | 48 | 0.06 |
| 1 | 1.6 | 72 | 0.08 |
| 编号Number | 发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 发酵时间 Fermentation time （B） | 菌添加量 Strain inoculum volume （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） | 编号Number | 发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 发酵时间 Fermentation time （B） | 菌添加量 Strain inoculum volume （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | -1 | 0 | 1 | 9.79 | 10 | 1 | 0 | 1 | 11.81 |
| 2 | -1 | 0 | -1 | 10.23 | 11 | -1 | -1 | 0 | 8.28 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 11.50 | 12 | 0 | 0 | 0 | 11.70 |
| 4 | 1 | 0 | -1 | 10.70 | 13 | 0 | -1 | 1 | 9.11 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 11.62 | 14 | 0 | 0 | 0 | 11.61 |
| 6 | 0 | -1 | -1 | 8.50 | 15 | 1 | 1 | 0 | 9.50 |
| 7 | 1 | -1 | 0 | 9.04 | 16 | 0 | 0 | 0 | 11.90 |
| 8 | -1 | 1 | 0 | 9.30 | 17 | 0 | 1 | 1 | 9.41 |
| 9 | 0 | 1 | -1 | 9.70 |
Table 2 Box-Behnken design scheme and results for fermentation process
| 编号Number | 发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 发酵时间 Fermentation time （B） | 菌添加量 Strain inoculum volume （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） | 编号Number | 发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 发酵时间 Fermentation time （B） | 菌添加量 Strain inoculum volume （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | -1 | 0 | 1 | 9.79 | 10 | 1 | 0 | 1 | 11.81 |
| 2 | -1 | 0 | -1 | 10.23 | 11 | -1 | -1 | 0 | 8.28 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 11.50 | 12 | 0 | 0 | 0 | 11.70 |
| 4 | 1 | 0 | -1 | 10.70 | 13 | 0 | -1 | 1 | 9.11 |
| 5 | 0 | 0 | 0 | 11.62 | 14 | 0 | 0 | 0 | 11.61 |
| 6 | 0 | -1 | -1 | 8.50 | 15 | 1 | 1 | 0 | 9.50 |
| 7 | 1 | -1 | 0 | 9.04 | 16 | 0 | 0 | 0 | 11.90 |
| 8 | -1 | 1 | 0 | 9.30 | 17 | 0 | 1 | 1 | 9.41 |
| 9 | 0 | 1 | -1 | 9.70 |
方差来源 Source of variance | 平方和 Sum of squares | 自由度 Degree of freedom （df） | 均方 Mean square | F值 F-value | P值 P-value | 显著性 Significance |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型Model | 24.72 | 9 | 2.75 | 48.67 | <0.0001 | ** |
| 发酵料液比Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 1.48 | 1 | 1.48 | 26.25 | 0.0014 | ** |
| 发酵时间Fermentation time （B） | 1.11 | 1 | 1.11 | 19.62 | 0.0030 | ** |
| 菌种添加量Strain inoculum volume （C） | 0.12 | 1 | 0.12 | 2.07 | 0.1929 | NS |
| AB | 0.08 | 1 | 0.08 | 1.42 | 0.2716 | NS |
| AC | 0.60 | 1 | 0.60 | 10.58 | 0.0140 | * |
| BC | 0.20 | 1 | 0.20 | 3.62 | 0.0990 | NS |
| A2 | 1.48 | 1 | 1.48 | 26.17 | 0.0014 | ** |
| B2 | 17.59 | 1 | 17.59 | 311.65 | <0.0001 | ** |
| C2 | 0.83 | 1 | 0.83 | 14.68 | 0.0064 | ** |
| 残差Residual | 0.40 | 7 | 0.06 | |||
| 失拟项Lack of fit | 0.31 | 3 | 0.10 | 4.64 | 0.0862 | NS |
| 纯误差Pure error | 0.09 | 4 | 0.02 | |||
| 总离差Total deviation | 25.12 | 16 | ||||
| R2 | 0.9843 | |||||
| R2Adj | 0.9640 |
Table 3 Analysis of variance for the regression model of saponin yield in fermentation process
方差来源 Source of variance | 平方和 Sum of squares | 自由度 Degree of freedom （df） | 均方 Mean square | F值 F-value | P值 P-value | 显著性 Significance |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型Model | 24.72 | 9 | 2.75 | 48.67 | <0.0001 | ** |
| 发酵料液比Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 1.48 | 1 | 1.48 | 26.25 | 0.0014 | ** |
| 发酵时间Fermentation time （B） | 1.11 | 1 | 1.11 | 19.62 | 0.0030 | ** |
| 菌种添加量Strain inoculum volume （C） | 0.12 | 1 | 0.12 | 2.07 | 0.1929 | NS |
| AB | 0.08 | 1 | 0.08 | 1.42 | 0.2716 | NS |
| AC | 0.60 | 1 | 0.60 | 10.58 | 0.0140 | * |
| BC | 0.20 | 1 | 0.20 | 3.62 | 0.0990 | NS |
| A2 | 1.48 | 1 | 1.48 | 26.17 | 0.0014 | ** |
| B2 | 17.59 | 1 | 17.59 | 311.65 | <0.0001 | ** |
| C2 | 0.83 | 1 | 0.83 | 14.68 | 0.0064 | ** |
| 残差Residual | 0.40 | 7 | 0.06 | |||
| 失拟项Lack of fit | 0.31 | 3 | 0.10 | 4.64 | 0.0862 | NS |
| 纯误差Pure error | 0.09 | 4 | 0.02 | |||
| 总离差Total deviation | 25.12 | 16 | ||||
| R2 | 0.9843 | |||||
| R2Adj | 0.9640 |
Fig.5 Contour plot （a） and response surface plot （b） of the interaction between fermentation solid-to-liquid ratio （A） and fermentation time （B）
Fig.6 Contour plot （a） and response surface plot （b） of the interaction between fermentation solid-to-liquid ratio （A） and strain inoculum volume （C）
Fig.7 Contour plot （a） and response surface plot （b） of the interaction between fermentation time （B） and strain inoculum volume （C）
项目 Items | 评价标准 Evaluation criteria | 变量下限 Variable lower limit | 变量上限 Variable upper limit | 权重下限 Weight lower limit | 权重上限 Weight upper limit | 影响程度 Degree of influence |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 发酵料液比Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 区间内Within the range | 0.8 | 1.6 | 1 | 1 | 3 |
| 发酵时间Fermentation time （B， h） | 区间内Within the range | 24 | 72 | 1 | 1 | 3 |
| 菌添加量Strain inoculum volume （C， mL） | 区间内Within the range | 0.04 | 0.08 | 1 | 1 | 3 |
| 皂苷得率Yield of saponins （%） | 最大值Maximum | 8.28 | 11.90 | 1 | 1 | 3 |
Table 4 Value ranges and prediction intervals of different fermentation factors
项目 Items | 评价标准 Evaluation criteria | 变量下限 Variable lower limit | 变量上限 Variable upper limit | 权重下限 Weight lower limit | 权重上限 Weight upper limit | 影响程度 Degree of influence |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 发酵料液比Fermentation solid-to-liquid ratio （A） | 区间内Within the range | 0.8 | 1.6 | 1 | 1 | 3 |
| 发酵时间Fermentation time （B， h） | 区间内Within the range | 24 | 72 | 1 | 1 | 3 |
| 菌添加量Strain inoculum volume （C， mL） | 区间内Within the range | 0.04 | 0.08 | 1 | 1 | 3 |
| 皂苷得率Yield of saponins （%） | 最大值Maximum | 8.28 | 11.90 | 1 | 1 | 3 |
发酵工艺 Fermentation process | 模型预测皂苷得率 Model prediction of saponin yield （%） | 模型验证皂苷得率 Model validation of saponin yield （%） | 理想程度 Desirability | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio | 发酵时间 Fermentation time （h） | 菌添加量 Strain inoculum volume （mL） | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | P值 P-value | |
| 1∶1.27 | 50.3 | 0.062 | 11.75 | 7.21 | 11.68±0.15a | 6.99±0.39b | 0.0177 | 0.95 |
Table 5 Optimal fermentation technology and extraction yield of alfalfa saponins
发酵工艺 Fermentation process | 模型预测皂苷得率 Model prediction of saponin yield （%） | 模型验证皂苷得率 Model validation of saponin yield （%） | 理想程度 Desirability | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
发酵料液比 Fermentation solid-to-liquid ratio | 发酵时间 Fermentation time （h） | 菌添加量 Strain inoculum volume （mL） | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | P值 P-value | |
| 1∶1.27 | 50.3 | 0.062 | 11.75 | 7.21 | 11.68±0.15a | 6.99±0.39b | 0.0177 | 0.95 |
Fig.8 Effects of strain type and ultrasonication time on alfalfa saponin yield
Fig.9 Effects of strain type and ultrasonication temperature on alfalfa saponin yield
Fig.10 Effects of strain type and ultrasonication solid-to-liquid ratio on alfalfa saponin yield
水平 Level | 超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 超声时间 Ultrasonication time （B， min） | 超声温度 Ultrasonication temperature （C， ℃） |
|---|---|---|---|
| -1 | 10 | 60 | 37 |
| 0 | 20 | 75 | 49 |
| 1 | 30 | 90 | 61 |
Table 6 Factors and levels of Box-Behnken design for ultrasonic process
水平 Level | 超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 超声时间 Ultrasonication time （B， min） | 超声温度 Ultrasonication temperature （C， ℃） |
|---|---|---|---|
| -1 | 10 | 60 | 37 |
| 0 | 20 | 75 | 49 |
| 1 | 30 | 90 | 61 |
| 编号Number | 超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 超声时间 Ultrasonication time （B） | 超声温度 Ultrasonication temperature （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） | 编号Number | 超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 超声时间 Ultrasonication time （B） | 超声温度 Ultrasonication temperature （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0 | -1 | -1 | 13.14 | 10 | 0 | 0 | 0 | 13.73 |
| 2 | 1 | 0 | 1 | 12.37 | 11 | 0 | 0 | 0 | 13.99 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 13.75 | 12 | 1 | -1 | 0 | 12.99 |
| 4 | 0 | 1 | 1 | 12.04 | 13 | -1 | -1 | 0 | 12.62 |
| 5 | 1 | 1 | 0 | 12.76 | 14 | 0 | 0 | 0 | 13.64 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 14.06 | 15 | 0 | -1 | 1 | 11.94 |
| 7 | -1 | 1 | 0 | 12.06 | 16 | -1 | 0 | 1 | 12.01 |
| 8 | 1 | 0 | -1 | 13.39 | 17 | -1 | 0 | -1 | 11.35 |
| 9 | 0 | 1 | -1 | 11.06 |
Table 7 Box-Behnken design scheme and results for ultrasonic process
| 编号Number | 超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 超声时间 Ultrasonication time （B） | 超声温度 Ultrasonication temperature （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） | 编号Number | 超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 超声时间 Ultrasonication time （B） | 超声温度 Ultrasonication temperature （C） | 皂苷得率 Yield of saponins （%） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0 | -1 | -1 | 13.14 | 10 | 0 | 0 | 0 | 13.73 |
| 2 | 1 | 0 | 1 | 12.37 | 11 | 0 | 0 | 0 | 13.99 |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 13.75 | 12 | 1 | -1 | 0 | 12.99 |
| 4 | 0 | 1 | 1 | 12.04 | 13 | -1 | -1 | 0 | 12.62 |
| 5 | 1 | 1 | 0 | 12.76 | 14 | 0 | 0 | 0 | 13.64 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 14.06 | 15 | 0 | -1 | 1 | 11.94 |
| 7 | -1 | 1 | 0 | 12.06 | 16 | -1 | 0 | 1 | 12.01 |
| 8 | 1 | 0 | -1 | 13.39 | 17 | -1 | 0 | -1 | 11.35 |
| 9 | 0 | 1 | -1 | 11.06 |
方差来源 Source of variance | 平方和 Sum of squares | df | 均方 Mean square | F值 F-value | P值 P-value | 显著性 Significance |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型Model | 13.23 | 9 | 1.47 | 19.44 | 0.0004 | ** |
| 超声料液比Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 1.49 | 1 | 1.49 | 19.74 | 0.0030 | ** |
| 超声时间Ultrasonication time （B） | 0.96 | 1 | 0.96 | 12.66 | 0.0092 | ** |
| 超声温度Ultrasonication temperature （C） | 0.04 | 1 | 0.04 | 0.56 | 0.4793 | NS |
| AB | 0.03 | 1 | 0.03 | 0.37 | 0.5624 | NS |
| AC | 0.71 | 1 | 0.71 | 9.43 | 0.0180 | * |
| BC | 1.20 | 1 | 1.20 | 15.83 | 0.0053 | ** |
| A2 | 1.03 | 1 | 1.03 | 13.61 | 0.0078 | ** |
| B2 | 2.25 | 1 | 2.25 | 29.73 | 0.0010 | ** |
| C2 | 4.70 | 1 | 4.70 | 62.09 | 0.0001 | ** |
| 残差Residual | 0.53 | 7 | 0.08 | |||
| 失拟项Lack of fit | 0.40 | 3 | 0.13 | 4.05 | 0.1051 | NS |
| 纯误差Pure error | 0.13 | 4 | 0.03 | |||
| 总离差Total deviation | 13.76 | 16 | ||||
| R2 | 0.9615 | |||||
| R2Adj | 0.9121 |
Table 8 Analysis of variance for the regression model of saponin yield in ultrasonic process
方差来源 Source of variance | 平方和 Sum of squares | df | 均方 Mean square | F值 F-value | P值 P-value | 显著性 Significance |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型Model | 13.23 | 9 | 1.47 | 19.44 | 0.0004 | ** |
| 超声料液比Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 1.49 | 1 | 1.49 | 19.74 | 0.0030 | ** |
| 超声时间Ultrasonication time （B） | 0.96 | 1 | 0.96 | 12.66 | 0.0092 | ** |
| 超声温度Ultrasonication temperature （C） | 0.04 | 1 | 0.04 | 0.56 | 0.4793 | NS |
| AB | 0.03 | 1 | 0.03 | 0.37 | 0.5624 | NS |
| AC | 0.71 | 1 | 0.71 | 9.43 | 0.0180 | * |
| BC | 1.20 | 1 | 1.20 | 15.83 | 0.0053 | ** |
| A2 | 1.03 | 1 | 1.03 | 13.61 | 0.0078 | ** |
| B2 | 2.25 | 1 | 2.25 | 29.73 | 0.0010 | ** |
| C2 | 4.70 | 1 | 4.70 | 62.09 | 0.0001 | ** |
| 残差Residual | 0.53 | 7 | 0.08 | |||
| 失拟项Lack of fit | 0.40 | 3 | 0.13 | 4.05 | 0.1051 | NS |
| 纯误差Pure error | 0.13 | 4 | 0.03 | |||
| 总离差Total deviation | 13.76 | 16 | ||||
| R2 | 0.9615 | |||||
| R2Adj | 0.9121 |
Fig.11 Contour plot （a） and response surface plot （b） of the interaction between ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） and ultrasonication time （B）
Fig.12 Contour plot （a） and response surface plot （b） of the interaction of ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） and ultrasonication temperature （C）
Fig.13 Contour plot （a） and response surface plot （b） of the interaction of ultrasonication time （B） and ultrasonication temperature （C）
项目 Items | 评价标准 Evaluation criteria | 变量下限 Variable lower limit | 变量上限 Variable upper limit | 权重下限 Weight lower limit | 权重上限 Weight upper limit | 影响程度 Degree of influence |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 超声料液比Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 区间内Within the range | 10 | 30 | 1 | 1 | 3 |
| 超声时间Ultrasonication time （B， min） | 区间内Within the range | 60 | 90 | 1 | 1 | 3 |
| 超声温度Ultrasonication temperature （C， ℃） | 区间内Within the range | 37 | 61 | 1 | 1 | 3 |
| 皂苷得率Yield of saponins （%） | 最大值Maximum | 11.06 | 14.06 | 1 | 1 | 3 |
Table 9 Value ranges and prediction intervals of different ultrasonication factors
项目 Items | 评价标准 Evaluation criteria | 变量下限 Variable lower limit | 变量上限 Variable upper limit | 权重下限 Weight lower limit | 权重上限 Weight upper limit | 影响程度 Degree of influence |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 超声料液比Ultrasonication solid-to-liquid ratio （A） | 区间内Within the range | 10 | 30 | 1 | 1 | 3 |
| 超声时间Ultrasonication time （B， min） | 区间内Within the range | 60 | 90 | 1 | 1 | 3 |
| 超声温度Ultrasonication temperature （C， ℃） | 区间内Within the range | 37 | 61 | 1 | 1 | 3 |
| 皂苷得率Yield of saponins （%） | 最大值Maximum | 11.06 | 14.06 | 1 | 1 | 3 |
超声工艺 Ultrasonication process | 模型预测皂苷得率 Model prediction of saponin yield （%） | 模型验证皂苷得率 Model validation of saponin yield （%） | P值 P-value | 理想 程度 Desirability | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio | 超声时间 Ultrasonication time （min） | 超声温度 Ultrasonication temperature （℃） | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | ||
| 1∶23.1 | 72.7 | 47.3 | 13.97 | 7.21 | 13.87±0.34a | 6.99±0.39b | 0.0042 | 0.96 |
Table 10 Optimal ultrasonication technology and extraction yield of alfalfa saponins
超声工艺 Ultrasonication process | 模型预测皂苷得率 Model prediction of saponin yield （%） | 模型验证皂苷得率 Model validation of saponin yield （%） | P值 P-value | 理想 程度 Desirability | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
超声料液比 Ultrasonication solid-to-liquid ratio | 超声时间 Ultrasonication time （min） | 超声温度 Ultrasonication temperature （℃） | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | 复合菌组 Composite bacteria group | 未加菌组 No bacteria group | ||
| 1∶23.1 | 72.7 | 47.3 | 13.97 | 7.21 | 13.87±0.34a | 6.99±0.39b | 0.0042 | 0.96 |
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