基于小RNA深度测序技术的苜蓿病毒病鉴定与分析

doi:10.11686/cyxb2023053

摘要/Abstract

摘要：

紫花苜蓿是一种重要的牧草，然而紫花苜蓿病毒病的侵染严重影响其品质。本研究通过小RNA深度测序技术和RT-PCR/PCR的方法对采自山西农业大学植物园中表现花叶、皱缩、卷曲的紫花苜蓿样品进行病毒病原的鉴定，结果表明病样被苜蓿花叶病毒（AMV）、豌豆线条病毒（PeSV）、苜蓿矮化病毒（ADV）和苜蓿卷叶病毒（ALCV）4种病毒复合侵染。PCR扩增获得了ALCV山西太谷紫花苜蓿分离物SXTG（OP748371）的全基因组序列，分析表明该分离物与ALCV阿根廷紫花苜蓿分离物Colonia Dora（MG792026）的序列相似性最高，达到97.34%。对扩增获得的AMV CP基因（OP748369）核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行序列比对分析显示，AMV山西太谷紫花苜蓿分离物SX与阿根廷紫花苜蓿AMV分离物ACat（MW835977）相似性最高，核苷酸和氨基酸相似性分别为99.24%和99.54%。同样将扩增获得的ADV CP基因序列上传至GenBank获得登录号OP957285，命名为ADV山西太谷紫花苜蓿分离物（SXJZ），通过序列分析表明该分离物与ADV分离物N1（MZ221810）亲缘关系最近，氨基酸序列相似性达到99.43%。进一步对扩增获得的PeSV CP基因编码的氨基酸（OQ108501）进行序列比对分析显示，PeSV山西紫花苜蓿分离物（SXJZ）与其他PeSV分离物CP基因编码的氨基酸相似性达到100%。这是首次从种植于山西的紫花苜蓿上检测到ALCV、ADV、AMV和PeSV的复合侵染，该研究结果有助于深入了解侵染紫花苜蓿的病毒病分子进化，为病毒病的防控提供一定的理论依据。

关键词: 紫花苜蓿, 苜蓿花叶病毒, 苜蓿卷叶病毒, 苜蓿矮缩病毒, 豌豆线条病毒, 序列分析

Abstract:

Medicago sativa is an important forage， but the infection with alfalfa virus disease seriously affects the yield and nutritional quality of alfalfa. In this study， the virus pathogens of alfalfa samples， which exhibited mosaic， wrinkled， and curled leaves， collected from Botanical Garden of Shanxi Agricultural University were identified by small RNA deep sequencing technology and RT-PCR/PCR methods. It was found that the diseased leaf samples were co-infected by alfalfa mosaic virus （AMV）， pea streak virus （PeSV）， alfalfa dwarf virus （ADV） and alfalfa leaf curl virus （ALCV）. The whole genome sequence of ALCV isolate SXTG （OP748371） was obtained by PCR amplification. Sequence analysis showed that the complete sequence of ALCV isolate SXTG shared the highest similarity with the ALCV isolate Colonia Dora （MG792026）， namely 97.34%. Sequence alignment analysis of the AMV CP gene （OP748369） nucleoside sequence and its encoded amino acid sequences showed that the AMV isolate SX had the highest similarity with the AMV isolate ACat （MW835977）， with nucleotide and amino acid similarities of 99.24% and 99.54%， respectively. Similarly， the amplified ADV CP gene sequence was uploaded to GenBank， the registration number OP957285 was obtained and the isolate was named ADV Shanxi Taigu alfalfa isolate （SXJZ）. Sequence analysis showed that the isolate SXJZ had the closest genetic relationship with ADV isolate N1 （MZ221810）， with an amino acid sequence similarity of 99.43%. Further sequence alignment analysis of the amino acid （OQ108501） encoded by PeSV CP gene showed that the similarity of the amino acid encoded by the coat protein of the Shanxi alfalfa isolate （SXJZ） and other PeSV isolates was 100%. This is the first time that the compound infection of ALCV， ADV， AMV and PeSV has been detected in alfalfa plants in Shanxi Province. These results will help to understand the molecular evolution of the virus disease infecting alfalfa and provide a theoretical basis for the prevention and control of the virus disease.

Key words: Medicago sativa, alfalfa mosaic virus, alfalfa leaf curl virus, alfalfa dwarf virus, pea streak virus, sequence analysis

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图/表 13

表1 本研究中使用的引物

Table 1 Primers used in this study

病毒名称 Virus	引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence （5′-3′）	退火温度 Annealing temperature （℃）	片段 Fragment （bp）
ADV	ADV-CP-F	ACGTCGGATTCCAGTTGTATC	56	1450
ADV	ADV-CP-R	TTGGTCGTCATTCAGTCACCACT	56	1450
AMV	AMV-CP-F	TCAAATACTTCCATCATGAGT	55	680
AMV	AMV-CP-R	AATGGGGTACATCAATGACGATC	55	680
PeSV	PeSV-CP-F	AGTTTGCAGAAGAAGAATTTG	56	1000
PeSV	PeSV-CP-R	ACAAGCATTAAAAATATATTAAAAC	56	1000
ALCV	ALCV-F	CGAGATCCGGGAGAACATATG	58	2700
ALCV	ALCV-R	CCCGGATCTCGTGCGAACCATC	58	2700

图1 田间紫花苜蓿感病症状1：感病植株Infected plant； 2：健康植株Healthy plant.

Fig.1 Symptoms of M. sativa plant in fields

图2 sRNA长度分布

Fig.2 Small RNA length distribution

图3 紫花苜蓿3种病毒组装序列在基因组中的位置和分布

Fig.3 Position and distribution of 3 M. sativa viruses assembly contigs in the genome

图4 感病样品的PCR扩增M：标记Marker； CK：未加模板扩增的负对照Negative control without template.

Fig.4 PCR amplification from the sample

表2 AMV-SX与其他AMV分离物的CP基因核苷酸序列及氨基酸序列一致性

Table 2 Nucleotide and amino acid sequence identities of CP gene between SX and other AMV isolates

GenBank 编号 GenBank number	分离物 Isolate	寄主植物 Host	国家 Country	一致性Identity （%）
GenBank 编号 GenBank number	分离物 Isolate	寄主植物 Host	国家 Country	核苷酸 Nucleotide	氨基酸 Amino acid
OP748369	SX	苜蓿M. sativa	中国China	100.00	100.00
KX535524	Ke.Si.Ru	酸模Rumex spp.	伊朗Iran	99.23	98.62
KX535473	Az.Ta.A	苜蓿M. sativa	伊朗Iran	99.23	98.62
MW835977	ACat	苜蓿M. sativa	阿根廷Argentina	99.24	99.54
MW835969	ASdE	苜蓿M. sativa	阿根廷Argentina	99.23	99.08
OL706264	Helinger-N1	苜蓿M. sativa	中国China	99.23	99.08
MT093211	See-1	佛手瓜Sechium edule	意大利Italy	99.23	99.08
MN846749	BJFi1	花蓟马Frankliniella intonsa	中国China	99.23	99.08
HQ185569	Joe Davis	大豆Glycine max	美国USA	97.60	98.19
OL706257	Yuanyang-1/H2	苜蓿M. sativa	中国China	97.56	99.08
MZ221782	Helinger-N1	苜蓿M. sativa	中国China	97.45	97.74
MZ221778	Yuanyang-1/H2	苜蓿M. sativa	中国China	99.09	99.08
ON669107	R3_ALF1071	苜蓿M. sativa	美国USA	98.93	98.62
OL706259	Lankao-H4	苜蓿M. sativa	中国China	98.93	99.08
MT787570	BJMs2	苜蓿M. sativa	中国China	98.93	98.62
OL706262	Yichuan-H7	苜蓿M. sativa	中国China	98.78	99.08
MW369445	37Sm	茄子Solanum melongena	塞尔维亚Serbia	97.57	97.25
HM807305	S30	大豆G. max	澳大利亚Australia	96.85	97.74

图5 AMV-SX外壳蛋白氨基酸系统发育分析

Fig.5 Phylogenetic analysis of AMV-SX CP amino acid

图6 ADV-SXJZ外壳蛋白氨基酸相似性比对彩色单元格表示两个序列的相似性得分The colored cell represents the pairwise identity score for two sequences；下同The same below.

Fig.6 Pairwise amino acid sequence identity of ADV-SXJZ CP to other ADV

图7 ADV-SXJZ外壳蛋白氨基酸系统发育分析

Fig.7 Phylogenetic analysis of ADV-SXJZ CP amino acid

图8 ALCV-SXTG核苷酸相似性比对

Fig.8 Pairwise amino acid sequence identity of ALCV-SXTG to other ALCV

图9 ALCV-SXTG基因全长系统发育分析

Fig.9 Phylogenetic analysis on genome sequence of ALCV-SXTG and other reported isolates

图10 PeSV-SXJZ外壳蛋白核苷酸相似性比对

Fig.10 Pairwise amino acid sequence identity of PeSV-SXJZ CP gene to other PeSV

图11 PeSV-SXJZ外壳蛋白氨基酸系统发育分析

Fig.11 Phylogenetic analysis of genome sequence of PeSV-SXJZ CP amino acid

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