荒漠草地白刺粗角叶甲非典型气味受体基因克隆及组织表达谱

doi:10.11686/cyxb2023265

草业学报 ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (5): 204-215.DOI: 10.11686/cyxb2023265

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荒漠草地白刺粗角叶甲非典型气味受体基因克隆及组织表达谱

席驳鑫¹(), 崔晓宁²(), 尚素琴¹, 胡桂馨², 王彦¹, 李昌宁², 彭斌², 史薛强²

^1.甘肃农业大学植物保护学院，甘肃兰州 730070
^2.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃兰州 730070

收稿日期:2023-07-25 修回日期:2023-10-08 出版日期:2024-05-20 发布日期:2024-02-03
通讯作者: 崔晓宁
作者简介:Corresponding author. E-mail： cxn213@qq.com
席驳鑫（1995-），男，甘肃镇原人，在读硕士。E-mail： sxqxbx@outlook.com
基金资助:
国家自然科学基金(32060397);甘肃农业大学博士科研启动基金(GAU-KYQD-2018-24);国家现代农业产业技术体系(CARS-34)

Cloning and tissue-specific expression patterns of a gene encoding an atypical odorant receptor co-receptor in the leaf beetle Diorhabda rybakowi （Coleoptera： Chrysomelidae）

Bo-xin XI¹(), Xiao-ning CUI²(), Su-qin SHANG¹, Gui-xin HU², Yan WANG¹, Chang-ning LI², Bin PENG², Xue-qiang SHI²

^1.College of Plant Protection，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China
^2.College of Pratacultural Science，Gansu Agricultural University，Key Laboratory for Grassland Ecosystem of Education Ministry，Lanzhou 730070，China

Received:2023-07-25 Revised:2023-10-08 Online:2024-05-20 Published:2024-02-03
Contact: Xiao-ning CUI

摘要/Abstract

摘要：

白刺粗角叶甲是我国西北荒漠草原危害防风固沙先锋植物白刺的重要害虫之一，开发和利用基于性信息素或寄主挥发物介导的昆虫化学通讯手段是防治该害虫的新途径。本研究以白刺粗角叶甲为对象，通过分子克隆技术获得白刺粗角叶甲成虫触角的非典型气味受体（atypical odorant receptor co-receptor，Orco）基因序列；利用同源建模方法预测蛋白三级结构，并构建系统发育树；借助荧光定量PCR技术检测DrybOrco基因在叶甲成虫各组织中的表达量差异。结果显示：克隆获得的白刺粗角叶甲非典型气味受体基因DrybOrco的cDNA全长为1918 bp，其中开放阅读框为1440 bp，编码479个氨基酸，蛋白分子量为53.94 kD，含有7个跨膜结构域，为疏水性膜蛋白。系统发育表明，Orco基因在6目68种昆虫间保守性较高（相似度大于68%），聚类分为3个分支，相同目的昆虫聚集到同一支。白刺粗角叶甲与其他鞘翅目昆虫聚为一支，其中与玉米根萤叶甲的Orco基因亲缘关系最近，核酸相似度高达92.28%。荧光定量表明，白刺粗角叶甲DrybOrco基因在成虫触角中特异性表达，且雄虫显著高于雌虫，表达量比值为2.27；此外，该基因在雄虫足和雌虫翅中少量表达，其他组织中几乎不表达。本研究明确了白刺粗角叶甲非典型气味受体基因DrybOrco的序列特征、蛋白结构和组织表达情况，这为阐明DrybOrco在该害虫化学通讯过程中的生理功能，以及探究白刺粗角叶甲寄主专化的嗅觉分子机制研究提供重要依据。

关键词: 白刺粗角叶甲, 嗅觉, 非典型气味受体, 克隆, 组织表达

Abstract:

The leaf beetle Diorhabda rybakowi is one of the most important insect pests causing serious damage to the pioneer plant Nitraria spp.， which has windbreak and sand-fixation functions in the desert grasslands of Northwest China. The development and utilization of a chemical method based on insect perception of sex pheromones or host volatiles is a promising pest control strategy. In this study， we obtained an atypical odorant receptor co-receptor （Orco） gene sequence from the antennae of D. rybakowi adults using a molecular cloning method. We predicted the tertiary structure of the DrybOrco protein using homology modeling， constructed a phylogenetic tree， and detected the transcript levels of the DrybOrco gene in different tissues of male and female adults by real-time fluorescence quantitative PCR. It was found that the DrybOrco full-length gene sequence was 1918 bp long， with an open reading frame of 1440 bp encoding 479 amino acids. The putative protein had a predicted molecular weight of 53.94 kD， contained seven transmembrane domains， and was a hydrophobic membrane protein.The phylogenetic analysis revealed high conservation of Orco genes among 68 species of insects in six different orders （similarity >68%）. In the phylogenetic tree， these genes grouped into three branches， with genes from the same insect order clustered on the same branch. The DrybOrco genewas clustered on the branch with sequences from other coleoptera species， and showed the highest nucleotide sequence similarity （92.28%） to the gene from Diabrotica virgifera. The qRT-PCR results showed that there were high transcript levels of the DrybOrco gene in the adult antennae， and with significantly higher levels （2.27 times higher） in the antennae of males than in the antennae of females. Low levels of DrybOrco transcripts were also detected in the legs of male adults and the wings of female adults， but its transcripts were barely detectable or absent from the other sampled tissues. The results of this study reveal the sequence characteristics and transcript profiles of an Orco gene in D. rybakowi adults， and details of the structure and characteristics of the putative protein. These findings provide a theoretical basis for elucidating the physiological function of the DrybOrco protein in chemosensory processes， and for further detailed studies on the olfactory molecular mechanism of host specialization in D. rybakowi.

Key words: Diorhabda rybakowi, olfactory, atypical odorant receptor co-receptor, cloning, tissue expression

席驳鑫, 崔晓宁, 尚素琴, 胡桂馨, 王彦, 李昌宁, 彭斌, 史薛强. 荒漠草地白刺粗角叶甲非典型气味受体基因克隆及组织表达谱[J]. 草业学报, 2024, 33(5): 204-215.

Bo-xin XI, Xiao-ning CUI, Su-qin SHANG, Gui-xin HU, Yan WANG, Chang-ning LI, Bin PENG, Xue-qiang SHI. Cloning and tissue-specific expression patterns of a gene encoding an atypical odorant receptor co-receptor in the leaf beetle Diorhabda rybakowi （Coleoptera： Chrysomelidae）[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2024, 33(5): 204-215.

图/表 6

表1 白刺粗角叶甲DrybOrco基因的克隆和荧光定量PCR引物

Table 1 Primers used for cloning and real-time PCR of DrybOrco gene in D. rybakowi

引物名称 Primer name	5′→3′引物序列 5′→3′ primer sequence	产物大小 Product size （bp）	试验用途 Use of experiment
Orco-F	GATTAGTGAGTTTAAGATGTCGCA	1918	克隆Cloning
Orco-R	TGGTGTTGATGGAAGTTGG	1918	克隆Cloning
RPLS18-F	GACAAACGTGCGGGAGAA	102	荧光定量PCR Rreal-time PCR
RPLS18-R	CTGTTCAAAAACCAGTCGGG	102	荧光定量PCR Rreal-time PCR
RPL13A-F	CCGTTCCATTTTAGAGCTCCCT	158	荧光定量PCR Real-time PCR
RPL13A-R	CCAGGTACAACAACACGTTTCC	158	荧光定量PCR Real-time PCR
DOrco-F	GGATCCTGAAAACGAGAACG	157	荧光定量PCR Real-time PCR
DOrco-R	CAGATTCGCGTGCATTAGAG	157	荧光定量PCR Real-time PCR

图1 白刺粗角叶甲DrybOrco蛋白的二级结构蓝色：α螺旋；绿色：β转角；紫色：无规则卷曲；红色：延伸链。Blue： Alpha helix； Green： Beta turn； Purple： Random curl； Red： Extension chains. 标尺数值表示DrybOrco氨基酸位置。The scale numbers represent the position of DrybOrco amino acid.

Fig.1 Secondary structure of DrybOrco protein in D. rybakowi

图2 白刺粗角叶甲DrybOrco蛋白的三级结构α1~α7分别代表α1~α7螺旋，N、C分别代表该蛋白的N端和C端。α1-α7 represented α1-α7 helix， N and C represented N-terminal and C-terminal of DrybOrco protein， respectively.

Fig.2 Tertiary structure ofDrybOrco proteinin D. rybakowi

图3 白刺粗角叶甲与其他昆虫的Orco蛋白的氨基酸序列比对DrybOrco以红色五角星标记。下同。图中蓝色、粉红色和绿色分别代表相似度大于100%、75%、50%的区域；TM表示跨膜区；IC表示膜内区域；EC表示膜外区域。DrybOrcowas marked by red five-pointed star. The same below. Blue， pink， and green color areas indicated similarities greater than 100%， 75%， and 50%， respectively. TM： Transmembrane domains； IC： Intracellular domains； EC： Extracellular domains.OcomOrco：广聚萤叶甲的Orco Orcoof O. communa （QEE83332.1）；AquaOrco：榆紫叶甲的Orco Orcoof A. quadriimpressum （AJF94638.2）；AmacOrco：斑须按蚊的Orco Orco of A. maculipalpis （XP_050069771.1）；BaffOrco：锈斑熊蜂的Orco Orcoof B. affinis （XP_050577029.1）；PglaOrco：东方虎凤蝶的Orco Orcoof P. glaucus （WCC57399.1）.

Fig.3 Alignment of Orco amino acid sequences in D. rybakowi with other insect species

图4 基于DrybOrco与其他昆虫氨基酸序列构建的系统发育树不同物种均标示Orco氨基酸序列的缩写和GenBank登录号。The different species were marked with Orco amino acid abbreviation and GenBank accession number. ClecOrco：温带臭虫的Orco Orco of Cimex lectularius； LpraOrco：牧草盲蝽的Orco Orco of Lygus pratensis； AsutOrco：中黑苜蓿盲蝽的Orco Orco of Adelphocoris suturalis； AfasOrco：三点苜蓿盲蝽的Orco Orco of Adelphocoris fasciaticollis； MquaOrco：四线二叉叶蝉的Orco Orco of Macrosteles quadrilineatus； SgreOrco：沙漠蝗的Orco Orco of Schistocerca gregaria； NlugOrco：褐飞虱的Orco Orco of Nilaparvata lugens； SinvOrco：红火蚁的Orco Orco of Solenopsis invicta； CnigOrco：青脊竹蝗的Orco Orco of Ceracris nigricornis； HhalOrco：茶翅蝽的Orco Orco of Halyomorpha halys； HrhoOrco：重阳木锦斑蛾的Orco Orco of Histia rhodope； SfruOrco：草地贪夜蛾的Orco Orco of Spodoptera frugiperda； AyunOrco：云南锦斑蛾的Orco Orco of Achelura yunnanensis； CpunOrco：桃蛀螟的Orco Orco of Conogethes punctiferalis； PpolOrco：玉带凤蝶的Orco Orco of Papilio polytes； PmemOrco：美凤蝶的Orco Orco of Papilio memnon； PglaOrco：美洲虎纹凤蝶的Orco Orco of Papilio glaucus； SlitOrco：斜纹夜蛾的Orco Orco of Spodoptera litura； GcaeOrco：黄翅绢丝野螟的Orco Orco of Glyphodes caesalis； ScinOrco：槐尺蛾的Orco Orco of Semiothisa cinerearia； GmolOrco：梨小食心虫的Orco Orco of Grapholitha molesta； DvirOrco：玉米根萤叶甲的Orco Orco of D. virgifera； AquaOrco：紫榆叶甲的Orco Orco of A. quadriimpressum； TmadOrco：黑拟谷盗的Orco Orco of Tribolium madens； AverOrco：沙漠铁包甲虫的Orco Orco of Asbolus verrucosus； PyasOrco：枣食芽象甲的Orco Orco of Pachyrhinus yasumatsui； SoryOrco：米象的Orco Orco of Sitophilus oryzae； ItypOrco：云杉八齿小蠹的Orco Orco of Ips typographus； SvelOrco：大灰象的Orco Orco of Sympiezomias velatus； LdecOrco：马铃薯叶甲的Orco Orco of L. decemlineata； CchiOrco：绿豆象的Orco Orco of Callosobruchus chinensis； EsemOrco：波纹毛顶蛾的Orco Orco of Eriocrania semipurpurella； AmouOrco：毛捷蒂按蚊的Orco Orco of Anopheles moucheti； SpyrOrco：斜斑鼓额蚜蝇的Orco Orco of Scaeva pyrastri； AmacOrco：斑须按蚊的Orco Orco of A. maculipalpis； AsteOrco：斯氏按蚊的Orco Orco of Anopheles stephensi； AdarOrco：达氏按蚊的Orco Orco of Anopheles darlingi； AfunOrco：致死按蚊的Orco Orco of Anopheles funestus； BpyrOrco：火红熊蜂的Orco Orco of Bombus pyrosoma； AalbOrco：淡色按蚊的Orco Orco of Anopheles albimanus； BterOrco：欧洲熊蜂的Orco Orco of Bombus terrestris； BaffOrco：锈斑熊蜂的Orco Orco of B. affinis； LcapOrco：红醋栗穿孔蛾的Orco Orco of Lampronia capitella； BvanOrco：温哥华熊峰的Orco Orco of Bombus vancouverensis nearcticus； AnilOrco：乌有按蚊的Orco Orco of Anopheles nili； BkinOrco：瘿蜂的Orco Orco of Belonocnema kinseyi； CgigOrco：大分舌蜂的Orco Orco of Colletes gigas； ScalOrco：厩螫蝇的Orco Orco of Stomoxys calcitrans； BimpOrco：熊蜂的Orco Orco of Bombus impatiens； AcruOrco：按蚊的Orco Orco of Anopheles cruzii； FvarOrco：巴西无刺蜜蜂的Orco Orco of Frieseomelitta varia； HillOrco：亮斑扁角水虻的Orco Orco of Hermetia illucens； LbouOrco：环腹瘿蜂的Orco Orco of Leptopilina boulardi； HvitOrco：透茎扁头叶蝉的Orco Orco of Homalodisca vitripennis； AlucOrco：绿后丽盲蝽的Orco Orco of Apolygus lucorum； AtumOrco：蜂箱小甲虫的Orco Orco of Aethina tumida； AglaOrco：光肩星天牛的Orco Orco of Anoplophora glabripennis； HaxyOrco：异色瓢虫的Orco Orco of Harmonia axyridis； OtauOrco：食粪金龟的Orco Orco of Onthophagus taurus； CcarOrco：普通草蛉的Orco Orco of Chrysoperla carnea； SpicOrco：中美洲蝗虫的Orco Orco of Schistocerca piceifrons； GbimOrco：双斑蟋的Orco Orco of Gryllus bimaculatus.

Fig.4 Phylogenetic tree of DrybOrco with other insect species based on amino acid sequences

图5 白刺粗角叶甲DrybOrco基因在成虫不同组织中的表达量星号表示DrybOrco基因在同一组织雌雄之间存在显著性差异（*： P<0.05， **： P<0.01， ns： P>0.05）。不同大、小写字母分别表示DrybOrco基因在雌虫或雄虫不同组织间的显著性差异。Asterisk indicate significant difference of DrybOrco between female and male （*： P<0.05， **： P<0.01， ns： P>0.05）. Different uppercase or lowercase indicate significant differences of DrybOrco gene in different adult tissues for same sexes.

Fig.5 The relative expression of DrybOrco gene in different tissues of D. rybakowi adult

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荒漠草地白刺粗角叶甲非典型气味受体基因克隆及组织表达谱

Cloning and tissue-specific expression patterns of a gene encoding an atypical odorant receptor co-receptor in the leaf beetle Diorhabda rybakowi （Coleoptera： Chrysomelidae）

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