康宁木霉固态发酵改善茶渣营养价值

doi:10.11686/cyxb2021260

草业学报 ›› 2022, Vol. 31 ›› Issue (7): 96-110.DOI: 10.11686/cyxb2021260

康宁木霉固态发酵改善茶渣营养价值

崔艺燕¹(), 李家洲¹, 田志梅¹, 邓盾¹, 鲁慧杰¹, 刘志昌¹, 容庭¹, 马现永¹^,²()

^1.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广东广州 510640
^2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东茂名 525000

收稿日期:2021-06-29 修回日期:2021-09-08 出版日期:2022-07-20 发布日期:2022-06-01
通讯作者: 马现永
作者简介:E-mail： maxianyong@gdaas.cn
崔艺燕（1987-），女，广东佛山人，助理研究员，硕士。E-mail： 958117076@qq.com
基金资助:
省级农业科技创新推广及农业资源与生态环境保护建设项目(2021KJ266);广东省农业科学院农业优势产业科学团队建设项目(202118TD);广东省现代农业产业技术体系饲料创新团队项目(2021KJ115);广州市农村科技特派员项目(20212100077);科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）-杰出人才(R2020PY-JC001);优秀博士(R2020YJ-YB2002);韶关市科技计划项目(200731114530834)

Solid-state fermentation with Trichoderma koningii improves nutritional value of tea dregs

Yi-yan CUI¹(), Jia-zhou LI¹, Zhi-mei TIAN¹, Dun DENG¹, Hui-jie LU¹, Zhi-chang LIU¹, Ting RONG¹, Xian-yong MA¹^,²()

^1.Institute of Animal Science，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding，the Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China，Ministry of Agriculture，Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition，Guangdong Engineering Technology Research Center of Animal Meat Quality and Safety Control and Evaluation，Guangzhou 510640，China
^2.Maoming Branch，Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture，Maoming 525000，China

Received:2021-06-29 Revised:2021-09-08 Online:2022-07-20 Published:2022-06-01
Contact: Xian-yong MA

摘要/Abstract

摘要：

本试验旨在研究康宁木霉固态发酵茶渣，提高茶渣营养价值，并筛选出最佳的发酵条件。用单因素试验优化发酵茶渣的基质比例（茶渣∶玉米粉=6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）、料液比（3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵温度（25、28、31、34、37 ℃）和发酵时间（0、2、4、6、8、10、14、22 d）。以基质比例、发酵温度、接种量和发酵时间为影响因素，进行L9（3⁴）正交试验确定茶渣最优发酵条件。测定各组发酵产物粗蛋白质、粗脂肪、还原糖、黄酮、皂苷和咖啡因含量，计算各组合的综合评分。确定最优条件后进行对比试验，比较了发酵前后茶渣的营养成分、活性物质和游离氨基酸含量。结果表明：1）单因素试验中，以下条件的综合评分最高：基质比例为7∶3，料液比为5∶5，接种量为8%，发酵温度为31 ℃，发酵时间为6 d。2）正交试验表明，康宁木霉发酵茶渣（料液比为5∶5）的最佳条件是：基质比例为7.0∶2.5，发酵温度为31 ℃，接种量为7%，发酵时间为6或7 d。3）与未发酵茶渣相比，最优条件下发酵茶渣的粗蛋白质、还原糖、黄酮、咖啡因、多种游离氨基酸含量和必需氨基酸/总氨基酸、风味氨基酸/总氨基酸均显著提高（P<0.05），皂苷含量显著降低（P<0.001），粗脂肪含量与未发酵茶渣无显著差异（P>0.05）。发酵6和7 d的茶渣营养成分和活性物质含量无显著差异（P>0.05）。由此可见，康宁木霉发酵茶渣能够改善茶渣的营养价值。

关键词: 康宁木霉, 茶渣, 固态发酵, 营养价值

Abstract:

The purpose of this experiment was to study the solid-state fermentation of tea dregs （TDs） by Trichoderma koningii to improve the nutritional value of TDs， and identify the optimal fermentation conditions. A series of single factor experiments was used to optimize the substrate ratio （TDs∶corn meal=6∶4， 7∶3， 8∶2， 9∶1）， solid∶liquid ratio （3∶7， 4∶6， 5∶5， 6∶4， 7∶3）， inoculation amount （2%， 4%， 6%， 8%， 10%）， fermentation temperature （25， 28， 31， 34， 37 ℃）， and fermentation time （0， 2， 4， 6， 8， 10， 14， 22 d） in fermented TDs. The optimum fermentation conditions of TDs were identified by an L9 （3⁴） orthogonal test with substrate ratio， fermentation temperature， inoculation amount， and fermentation time. The contents of crude protein， ether extract， reducing sugar， flavonoids， saponins， and caffeine of different fermentation combinations were determined， and the multivariate scores of different groups were calculated. After determining the optimal conditions， a comparative experiment was carried out to compare the nutrients， active substances， and free amino acid contents of the TDs before and after fermentation. It was found that： 1） In the single factor tests， the multivariate scores of the following were the highest： substrate ratio 7∶3， solid∶liquid ratio 5∶5， inoculation amount 8%， fermentation temperature 31 ℃， and fermentation time 6 d. 2） The orthogonal test indicated that a substrate ratio of 7.0∶2.5， inoculation of 7% （1×10⁷ spore·mL^-1）， and a solid-liquid ratio of 5∶5 at 31 ℃ for 6 or 7 d would produce the optimal result. 3） Compared with unfermented TDs， the contents of crude protein， reducing sugar， flavonoids， caffeine， various free amino acids， essential amino acids∶total amino acids and flavor amino acids∶total amino acids of fermented TDs （under optimal conditions） were significantly increased （P<0.05）， the saponin content was significantly decreased （P<0.001）， and the ether extract content had no significant difference between fermented or unfermented TDs （P>0.05）. No significant differences in nutrients or levels of active compounds were detected in fermented TDs for 6 or 7 d （P>0.05）. In brief， the solid-state fermentation by T. koningii can improve nutritional value in TDs.

Key words: Trichoderma koningii, tea dregs, solid-state fermentation, nutritional value

崔艺燕, 李家洲, 田志梅, 邓盾, 鲁慧杰, 刘志昌, 容庭, 马现永. 康宁木霉固态发酵改善茶渣营养价值[J]. 草业学报, 2022, 31(7): 96-110.

Yi-yan CUI, Jia-zhou LI, Zhi-mei TIAN, Dun DENG, Hui-jie LU, Zhi-chang LIU, Ting RONG, Xian-yong MA. Solid-state fermentation with Trichoderma koningii improves nutritional value of tea dregs[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2022, 31(7): 96-110.

图/表 12

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项目Items	最高分Highest score	较高分Higher score	平均分Average score	较低分Lower score	最低分Lowest score
粗蛋白质 CP	25	18.75	12.5	6.25	0
粗脂肪 EE	20	15.00	10.0	5.00	0
还原糖 Reducing sugars	10	7.50	5.0	2.50	0
黄酮 Total flavonoids	15	11.25	7.5	3.75	0
皂苷 Saponins	0	3.75	7.5	11.25	15
咖啡因 Caffeine	0	3.75	7.5	11.25	15

项目Items	最高分Highest score	较高分Higher score	平均分Average score	较低分Lower score	最低分Lowest score
粗蛋白质 CP	25	18.75	12.5	6.25	0
粗脂肪 EE	20	15.00	10.0	5.00	0
还原糖 Reducing sugars	10	7.50	5.0	2.50	0
黄酮 Total flavonoids	15	11.25	7.5	3.75	0
皂苷 Saponins	0	3.75	7.5	11.25	15
咖啡因 Caffeine	0	3.75	7.5	11.25	15

基质比例 Substrate ratio	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	得分 Scores
6∶4	23.89d	2.57ab	28.68a	6.07a	196.57b	108.63c	66.25
7∶3	24.65c	2.82ab	19.80b	6.80a	206.50b	130.28b	70.00
8∶2	25.64b	2.26b	16.25c	6.16a	208.51b	152.64a	51.25
9∶1	26.34a	3.16a	15.12c	6.51a	249.86a	153.56a	60.00
SEM	0.18	0.20	0.61	0.21	11.10	3.97
P值 P value	<0.001	0.076	<0.001	0.199	0.046	0.001

基质比例 Substrate ratio	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	得分 Scores
6∶4	23.89d	2.57ab	28.68a	6.07a	196.57b	108.63c	66.25
7∶3	24.65c	2.82ab	19.80b	6.80a	206.50b	130.28b	70.00
8∶2	25.64b	2.26b	16.25c	6.16a	208.51b	152.64a	51.25
9∶1	26.34a	3.16a	15.12c	6.51a	249.86a	153.56a	60.00
SEM	0.18	0.20	0.61	0.21	11.10	3.97
P值 P value	<0.001	0.076	<0.001	0.199	0.046	0.001

料液比 Solid-liquid ratio	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	得分 Scores
3∶7	25.29a	3.57a	18.10d	5.61c	295.06a	149.59a	46.25
4∶6	25.43a	3.19b	21.29c	7.00a	256.50b	145.05a	65.00
5∶5	25.59a	2.71c	21.01c	6.18b	237.44b	145.94a	67.50
6∶4	23.63a	2.29d	32.53b	6.13b	254.63b	143.27a	40.00
7∶3	23.65a	2.32d	35.25a	4.57d	242.69b	127.57b	47.50
SEM	0.44	0.07	0.47	0.19	7.99	2.42
P值 P value	0.080	<0.001	<0.001	<0.001	0.005	0.003

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Solid-state fermentation with Trichoderma koningii improves nutritional value of tea dregs

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接种量 Inoculation amount （%）	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	得分 Scores
2	25.09a	2.16a	22.86b	5.37a	295.59a	152.40a	88.75
4	25.14a	2.13a	23.78b	5.38a	277.50a	151.27a	91.25
6	26.53a	2.27a	22.13b	4.59b	265.52a	154.67a	78.75
8	25.53a	1.94a	28.08a	5.73a	261.21a	154.13a	100.00
10	25.40a	1.96a	26.27a	4.58b	296.87a	151.14a	86.25
SEM	0.68	0.11	0.63	0.17	12.73	2.05
P值 P value	0.673	0.325	0.001	0.007	0.308	0.689

温度 Temperature （℃）	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	得分 Scores
25	25.29c	2.58a	25.53a	6.59a	264.04a	152.12bc	53.75
28	25.87bc	2.41a	22.14b	5.28b	252.56a	150.18c	56.25
31	27.09a	3.05a	26.77a	4.57b	234.35ab	161.23a	66.25
34	26.66ab	2.58a	22.86b	4.51b	217.61b	160.87a	56.25
37	26.18abc	2.69a	22.38b	5.20b	253.25a	157.51b	53.75
SEM	0.33	0.20	1.02	0.27	8.72	2.07
P值 P value	0.034	0.309	0.042	0.009	0.043	0.014

时间 Times （d）	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	得分 Scores
0	21.76d	1.51a	3.22e	6.12bcd	286.06a	107.84f	-
2	21.67d	1.52a	36.68a	6.19bcd	282.64a	114.48ef	48.75
4	24.77c	1.54a	21.92b	6.29bc	266.10ab	124.69de	52.50
6	25.11c	1.67a	21.93b	8.00a	249.47b	128.30d	70.00
8	25.63bc	1.67a	16.05c	6.91abc	251.71b	134.89cd	61.25
10	26.56b	1.67a	15.90c	7.13ab	215.93c	144.81bc	67.50
14	28.39a	1.71a	16.56c	5.35cd	215.75c	150.10ab	56.25
22	29.19a	1.89a	10.98d	4.62d	182.44d	157.01a	60.00
SEM	0.41	0.11	0.71	0.43	13.60	2.99
P值 P value	<0.001	0.363	<0.001	0.007	0.003	<0.001

指标 Index	试验组 Test groups	基质比例 Substrate ratio （kg∶kg， A）	发酵温度 Fermentation temperature （℃， B）	接种量 Inoculation amount （%， C）	发酵时间 Fermentation time （d， D）	粗蛋白质 CP （%）	粗脂肪 EE （%）	还原糖 Reducing sugars （%）	黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	皂苷 Saponins （mg·100g^-1）	咖啡因 Caffeine （mg·100g^-1）	得分Scores
	1	1	1	1	1	25.54	1.32	23.85	3.93	270.32	115.38	60.00
	2	1	2	2	2	27.06	1.13	24.82	3.59	328.62	138.63	49.17
	3	1	3	3	3	25.79	1.24	21.61	3.36	329.02	128.67	47.50
	4	2	1	2	3	25.86	1.31	20.99	5.92	331.53	130.96	45.42
	5	2	2	3	1	25.65	1.21	23.97	4.05	273.85	141.64	47.50
	6	2	3	1	2	25.09	1.40	26.45	4.15	271.50	142.52	43.33
	7	3	1	3	2	25.43	1.53	20.82	4.85	332.45	132.80	47.92
	8	3	2	1	3	26.56	1.51	22.61	4.66	322.68	143.52	58.75
	9	3	3	2	1	24.09	1.36	22.07	4.69	343.93	133.59	42.08
粗蛋白质 CP （%）	K₁	26.13	25.61	25.73	25.09	最优方案Optimum program A1B2C1D3
	K₂	25.53	26.42	25.67	25.86
	K₃	25.36	24.99	25.62	26.07
	R	0.76	1.43	0.11	0.98
粗脂肪 EE （%）	K₁	1.23	1.39	1.41	1.30	最优方案Optimum program A3B1C1D3
	K₂	1.31	1.28	1.26	1.35
	K₃	1.47	1.33	1.33	1.35
	R	0.24	0.10	0.14	0.06
还原糖 Reducing sugars （%）	K₁	23.43	21.88	24.30	23.30	最优方案Optimum program A2B2C1D2
	K₂	23.80	23.80	22.63	24.03
	K₃	21.83	23.38	22.13	21.73
	R	1.97	1.92	2.17	2.30
黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	K₁	3.63	4.90	4.25	4.22	最优方案Optimum program A3B1C2D3
	K₂	4.71	4.10	4.74	4.20
	K₃	4.73	4.07	4.09	4.65
	R	1.10	0.83	0.65	0.45
皂苷 Saponins （mg·100 g^-1）	K₁	309.32	311.43	288.17	296.03	最优方案Optimum program A2B2C1D1
	K₂	292.29	308.38	334.69	310.86
	K₃	333.02	314.82	311.77	327.75
	R	23.70	6.44	46.53	31.71
咖啡因 Caffeine （mg·100 g^-1）	K₁	127.56	126.38	133.81	130.20	最优方案Optimum program A1B1C1D1
	K₂	138.37	141.26	134.39	137.98
	K₃	136.64	134.93	134.37	134.39
	R	10.81	14.88	0.58	7.78
得分 Scores	K₁	52.22	51.11	54.03	49.86	最优方案Optimum program A1B2C1D3
	K₂	45.42	51.81	45.56	46.81
	K₃	49.58	44.31	47.64	50.56
	R	6.81	7.50	8.47	3.75

指标Index	方差来源Source	平方和Sum of squares	自由度df	均方Mean square	F 值F value	P值P value	显著性Significance
粗蛋白质 CP	A	2.893	2	1.447	4.327	0.029	*
	B	9.242	2	4.621	13.822	<0.001	***
	C	0.052	2	0.026	0.078	0.925	NS
	D	4.787	2	2.393	7.158	0.005	**
	误差Error	6.018	18	0.334
粗脂肪 EE	A	0.264	2	0.132	9.703	0.001	**
	B	0.049	2	0.024	1.803	0.193	NS
	C	0.092	2	0.046	3.402	0.056	NS
	D	0.019	2	0.009	0.695	0.512	NS
	误差Error	0.244	18	0.014
还原糖 Reducing sugars	A	19.756	2	9.878	0.856	0.441	NS
	B	18.223	2	9.112	0.790	0.469	NS
	C	23.282	2	11.641	1.009	0.384	NS
	D	24.734	2	12.367	1.072	0.363	NS
	误差Error	207.670	18	11.537
黄酮 Total flavonoids	A	7.153	2	3.576	3.708	0.045	*
	B	3.984	2	1.992	2.065	0.156	NS
	C	2.059	2	1.030	1.068	0.365	NS
	D	1.161	2	0.580	0.602	0.559	NS
	误差Error	17.361	18	0.965
皂苷 Saponins	A	7531.283	2	3765.641	1.383	0.276	NS
	B	186.623	2	93.312	0.034	0.966	NS
	C	9741.462	2	4870.731	1.789	0.196	NS
	D	4532.029	2	2266.015	0.832	0.451	NS
	误差Error	49010.298	18	2722.794
咖啡因 Caffeine	A	606.828	2	303.414	3.770	0.043	*
	B	1004.264	2	502.132	6.239	0.009	**
	C	1.967	2	0.984	0.012	0.988	NS
	D	272.892	2	136.446	1.695	0.212	NS
	误差Error	1448.605	18	80.478
得分 Scores	A	211.921	2	105.961	1.379	0.277	NS
	B	309.144	2	154.572	2.011	0.163	NS
	C	350.810	2	175.405	2.282	0.131	NS
	D	71.644	2	35.822	0.466	0.635	NS
	误差Error	1383.333	18	76.852

指标 Index	因素 Factor	水平Levels
指标 Index	因素 Factor	1	2	3
粗蛋白质 CP	A	26.13a	25.53b	25.36b
	B	25.61b	26.42a	24.99c
	C	25.73a	25.67a	25.62a
	D	25.09b	25.86a	26.07a
粗脂肪 EE	A	1.23b	1.31b	1.47a
	B	1.39a	1.28a	1.33a
	C	1.41a	1.26b	1.33ab
	D	1.230a	1.35a	1.35a
还原糖 Reducing sugars	A	23.43a	23.80a	21.83a
	B	21.88a	23.80a	23.38a
	C	24.30a	22.63a	22.13a
	D	23.30a	24.03a	21.73a
黄酮 Total flavonoids	A	3.63b	4.71a	4.73a
	B	4.90a	4.10a	4.07a
	C	4.25a	4.74a	4.09a
	D	4.22a	4.20a	4.65a
皂苷 Saponins	A	309.32a	292.29a	333.02a
	B	311.43a	308.38a	314.82a
	C	288.17a	334.69a	311.77a
	D	296.03a	310.86a	327.75a
咖啡因 Caffeine	A	127.56b	138.37a	136.64a
	B	126.38b	141.26a	134.93ab
	C	133.81a	134.37a	134.39a
	D	130.20a	137.98a	134.39a
得分 Scores	A	52.22a	45.42a	49.58a
	B	51.11a	51.81a	51.11a
	C	54.03a	45.56a	47.64a
	D	49.86a	46.81a	50.56a

项目 Items	未发酵茶渣 Unfermented tea dregs	发酵茶渣 Fermented tea dregs A1B2C1D2	发酵茶渣 Fermented tea dregs A1B2C1D3	SEM	P值 P value
粗蛋白质 CP （%）	21.67b	27.34a	27.85a	0.17	<0.001
粗脂肪 EE （%）	1.36a	1.53a	1.50a	0.05	0.154
还原糖 Reducing sugars （%）	7.98b	24.82a	23.81a	0.26	<0.001
黄酮 Total flavonoids （g·100 g^-1）	6.26b	10.59a	10.41a	0.73	<0.001
皂苷Saponins （mg·100 g^-1）	373.05a	300.48b	301.49b	5.55	<0.001
咖啡因Caffeine （mg·100 g^-1）	93.02b	110.17a	111.06a	1.30	<0.001

游离氨基酸 Free amino acids	未发酵茶渣 Unfermented tea dregs	发酵茶渣 Fermented tea dregs A1B2C1D2	发酵茶渣 Fermented tea dregs A1B2C1D3	SEM	P值 P value
缬氨酸 Valine	10.55a	12.03a	12.78a	0.93	0.728
异亮氨酸 Isoleucine	5.24b	15.98a	9.99a	1.02	0.008
亮氨酸 Leucine	11.95b	17.37a	15.50a	0.69	0.013
苏氨酸 Threonine	5.60c	12.44a	11.08b	0.22	<0.001
赖氨酸 Lysine	27.00c	55.35b	62.21a	1.25	<0.001
组氨酸 Histidine	8.61a	10.90a	10.76a	0.50	0.238
精氨酸 Arginine	18.58c	96.20b	106.41a	2.08	<0.001
苯丙氨酸 Phenylalanine	-	15.22a	15.84a	1.26	0.736
牛磺酸 Taurine	17.62c	46.23a	40.84b	1.15	<0.001
天冬氨酸 Aspartic acid	35.98b	36.87b	42.00a	0.74	<0.001
丝氨酸 Serine	9.47c	34.35a	31.63b	0.41	<0.001
磷酸丝氨酸 Phosphoserine	50.66c	121.27a	115.07b	1.56	<0.001
天冬酰胺 Asparagine	2.65b	26.86a	29.00a	0.77	<0.001
谷氨酸 Glutamate	28.04b	221.28a	221.34a	2.71	<0.001
谷氨酰胺 Glutamine	-	105.43a	98.68a	3.05	0.136
甘氨酸 Glycine	11.50a	8.56a	10.38a	1.20	0.635
丙氨酸 Alanine	21.99b	27.41a	25.79a	0.83	0.035
酪氨酸 Tyrosine	12.33b	24.99a	23.78a	1.01	<0.001
β-丙氨酸β-alanine	-	32.57a	36.26a	0.87	0.211
γ-氨基正丁酸 γ-aminobutyric acid	12.29b	38.14a	41.13a	1.14	<0.001
半胱氨酸 Cysteine	-	6.52a	4.66a	0.25	0.001
胱硫醚 Cystathionine	-	11.10a	11.58a	0.63	0.571
鸟氨酸 Ornithine	-	2.87a	3.07a	0.16	0.397
脯氨酸 Proline	8.73a	4.72a	7.92a	1.24	0.275
氨Ammonia	144.59a	5.66b	4.06b	2.03	<0.001
必需氨基酸 EAA	81.81b	233.68a	244.58a	7.32	<0.001
非必需氨基酸 NEAA	285.53b	690.00a	709.80a	20.06	<0.001
风味氨基酸 FAA	112.58b	340.92a	342.22a	5.37	<0.001
总氨基酸TAA	367.33b	923.68a	954.37a	26.41	<0.001
EAA/TAA	0.22b	0.25a	0.26a	0.01	0.005
NEAA/TAA	0.78a	0.75b	0.74b	0.01	0.005
FAA/TAA	0.30b	0.37a	0.36a	0.01	<0.001

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