Screening of internal reference genes of Lactobacillus strain OL77 and determination of CspP expression patterns under low-temperature and low-pH stress

doi:10.11686/cyxb2022183

Abstract

Abstract:

The aim of this study was to explore aspects of gene expression under low temperature and low pH in the cold-tolerant bacterium Pediococcus pentosaceus OL77， which was selected during low-temperature ensiling. To investigate the cold tolerance mechanism of P. pentosaceus OL77， we obtained its CspP gene by homologous cloning. GeNorm， NormFinder， BestKeeper， and RefFinder procedures were used to select internal reference genes with stable expression in OL77 under low-temperature and low-pH stress as detected using SYBR-Green real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR）. The selected internal reference genes were then used to analyze the transcriptional profile of CspP under low temperature. It was found that the relatively stably expressed internal reference genes of OL77 under low-temperature and low-pH stress were Ldh， tufa， and 6PGDH， while GAPDH and GyrA were not stably expressed. A gene fragment of CspP was obtained by homologous cloning， and its relative transcript levels in OL77 at 0， 1， 3， 6， 12 and 24 h of treatment at 25， 15 and 5 ℃ were analyzed using Ldh and 6PGDH as internal reference genes. The transient expression of CspP increased sharply under low temperature. Its transcript level was increased by 86 times at 5 ℃ compared with that at 25 ℃， suggesting that it plays roles in the cold tolerance of OL77. The cold tolerance of OL77 may result from increased expression of a cold shock protein at low temperature. Our findings suggest that CspP could be used as a cold tolerance indicator gene for OL77.

Key words: low temperature, low pH, internal reference gene, CspP gene, expression pattern

Ji-kuan CHAI, Ze-liang JU, Gui-qin ZHAO. Screening of internal reference genes of Lactobacillus strain OL77 and determination of CspP expression patterns under low-temperature and low-pH stress[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2023, 32(5): 147-158.

Figures/Tables 10

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基因名 Gene symbol	引物序列（5′-3′正向/反向） Primer sequence （5′-3′，forward/reverse）	产物长度 Product length （bp）	扩增效率 Amplification efficiency （%）
tufA	GAGAAGCGTCACTATGCCCA/CACCAACTTGACGTGCCAAC	166	101
rpoD	GGTGTTGGTGGCTATCCCAA/GGTGTTGGTGGCTATCCCAA	120	98
recA	GGTGTTGGTGGCTATCCCAA/GGTGTTGGTGGCTATCCCAA	114	96
Ldh	TCGTCCTACACCGACAATGC/AGTAGCCGAAATGGCGCTTA	151	99
GyrA	ACCGGAATTGCTGTTGGAATG/CATCAGGTCGGCTGTGGTAG	114	100
GyrB	TCTACCCGGAAAGTTGGCAG/TGAAGCTTTCCCCACGTTCA	166	98
GAPDH	TTGAATTGACCATGAGCTGTATC/TCGGACGTATTGGTCGTTTA	142	106
6PGDH	CTTCTTTGGCGATACAATTCG/CTAATGCGCCTAATTCACCA	98	103
CspP1	TGTAATAGATTACCCCTTGT/TTCTTGTGATTCCCCAGATT	164	99
CspP2	AACGACTGTTGCTTGTTCC/GCAAGTGTCAGGGTTTCTCT	111	98

基因名 Gene symbol	引物序列（5′-3′正向/反向） Primer sequence （5′-3′，forward/reverse）	产物长度 Product length （bp）	扩增效率 Amplification efficiency （%）
tufA	GAGAAGCGTCACTATGCCCA/CACCAACTTGACGTGCCAAC	166	101
rpoD	GGTGTTGGTGGCTATCCCAA/GGTGTTGGTGGCTATCCCAA	120	98
recA	GGTGTTGGTGGCTATCCCAA/GGTGTTGGTGGCTATCCCAA	114	96
Ldh	TCGTCCTACACCGACAATGC/AGTAGCCGAAATGGCGCTTA	151	99
GyrA	ACCGGAATTGCTGTTGGAATG/CATCAGGTCGGCTGTGGTAG	114	100
GyrB	TCTACCCGGAAAGTTGGCAG/TGAAGCTTTCCCCACGTTCA	166	98
GAPDH	TTGAATTGACCATGAGCTGTATC/TCGGACGTATTGGTCGTTTA	142	106
6PGDH	CTTCTTTGGCGATACAATTCG/CTAATGCGCCTAATTCACCA	98	103
CspP1	TGTAATAGATTACCCCTTGT/TTCTTGTGATTCCCCAGATT	164	99
CspP2	AACGACTGTTGCTTGTTCC/GCAAGTGTCAGGGTTTCTCT	111	98

项目Item	tufA	rpoD	recA	Ldh	GyrA	GyrB	GAPDH	6PGDH
pH
6.0	24.4	27.8	21.2	25.6	21.7	21.4	24.4	24.4
5.0	24.4	27.7	22.2	26.9	21.3	20.4	23.3	24.4
4.0	24.5	28.8	22.1	26.8	21.1	21.1	23.4	24.5
温度Temperature （℃）
25	24.7	27.3	22.3	24.4	20.5	20.8	21.3	24.7
15	24.8	24.5	22.1	24.9	21.1	21.0	20.7	24.8
5	24.6	22.0	22.5	24.8	20.5	21.3	21.9	24.6
均值Average	24.6	26.4	22.1	25.6	21.0	21.0	22.5	24.6
标准差Standard deviation （SD）	0.6	2.6	0.8	1.7	1.2	0.8	2.5	0.6
变异系数Coefficient of variation （CV， %）	2.4	10.0	3.4	6.5	5.9	3.7	11.3	2.4

项目Item	tufA	rpoD	recA	Ldh	GyrA	GyrB	GAPDH	6PGDH
pH
6.0	24.4	27.8	21.2	25.6	21.7	21.4	24.4	24.4
5.0	24.4	27.7	22.2	26.9	21.3	20.4	23.3	24.4
4.0	24.5	28.8	22.1	26.8	21.1	21.1	23.4	24.5
温度Temperature （℃）
25	24.7	27.3	22.3	24.4	20.5	20.8	21.3	24.7
15	24.8	24.5	22.1	24.9	21.1	21.0	20.7	24.8
5	24.6	22.0	22.5	24.8	20.5	21.3	21.9	24.6
均值Average	24.6	26.4	22.1	25.6	21.0	21.0	22.5	24.6
标准差Standard deviation （SD）	0.6	2.6	0.8	1.7	1.2	0.8	2.5	0.6
变异系数Coefficient of variation （CV， %）	2.4	10.0	3.4	6.5	5.9	3.7	11.3	2.4

项目 Item	排序Rank
项目 Item	1	2	3	4	5	6	7	8
pH
6.0	Ldh（0.06）	tufA（0.13）	GyrA（0.23）	6PGDH（0.33）	recA（0.54）	GAPDH（1.34）	GyrB（1.34）	rpoD（2.78）
5.0	GyrA（0.31）	rpoD（0.42）	GyrB（0.51）	Ldh（0.62）	6PGDH（0.70）	tufA（1.14）	recA（1.53）	GAPDH（1.80）
4.0	Ldh（0.03）	GyrA（0.03）	tufA（0.08）	recA（0.48）	GyrB（1.11）	6PGDH（1.30）	rpoD（1.69）	GAPDH（2.13）
温度Temperature （℃）
25	tufA（0.22）	6PGDH（0.42）	Ldh（0.62）	rpoD（0.64）	GyrB（0.73）	recA（0.77）	GyrA（0.94）	GAPDH（1.57）
15	GyrB（0.11）	Ldh（0.69）	tufA（0.90）	recA（1.00）	6PGDH（1.05）	GAPDH（1.43）	rpoD（1.67）	GyrA（1.88）
5	Ldh（0.10）	recA（0.43）	tufA（0.45）	6PGDH（0.48）	GyrB（0.48）	rpoD（0.90）	GyrA（1.29）	GAPDH（2.32）
总体Total	GyrB（0.26）	GyrA（0.34）	6PGDH（0.57）	Ldh（0.60）	tufA（0.73）	GAPDH（0.73）	recA（0.87）	rpoD（0.92）