红三叶多糖的酶提取方法及抗氧化活性研究

doi:10.11686/cyxb2023260

草业学报 ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (6): 105-115.DOI: 10.11686/cyxb2023260

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红三叶多糖的酶提取方法及抗氧化活性研究

祁兆奔¹(), 任晓艳¹, 李怡彤¹, 马金云², 刘权¹()

^1.兰州大学草地农业科技学院，草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室，红三叶高值化开发利用创新创业示范基地，甘肃兰州 730020
^2.和政县林草事业发展中心，甘肃临夏 731200

收稿日期:2023-07-25 修回日期:2023-09-11 出版日期:2024-06-20 发布日期:2024-03-20
通讯作者: 刘权
作者简介:E-mail： liuquan@lzu.edu.cn
祁兆奔（1997-），男，甘肃定西人，在读硕士。E-mail： qzhaoben@163.com
基金资助:
国家自然科学基金“红三叶与黑麦草混播过程中的化学互作研究”(31971763);甘肃省科技特派员创新创业示范基地“红三叶高值化开发利用创新创业示范基地”(20CX9NA106);阿拉善盟应用技术研究与开发资金计划(AMYY2022-19);定西市科技计划(DX2023AZ07)

Enzyme extraction method and antioxidant activity of polysaccharides from red clover

Zhao-ben QI¹(), Xiao-yan REN¹, Yi-tong LI¹, Jin-yun MA², Quan LIU¹()

^1.College of Pastoral Grassland Agriculture Science and Technology，State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems，Innovation and Entrepreneurship Demonstration Base of Red Clover High-value Utilization，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China
^2.Forestry and Grass Development Center，Hezheng County，Linxia 731200，China

Received:2023-07-25 Revised:2023-09-11 Online:2024-06-20 Published:2024-03-20
Contact: Quan LIU

摘要/Abstract

摘要：

红三叶是全世界种植范围较广的多年生豆科牧草，资源丰富，其多糖成分具有良好的降血糖和抗氧化活性，具有高附加值开发与利用的前景。酶提取条件相对温和，有利于提高多糖活性。本研究考察了酶解时间、酶用量、酶比例、酶解温度4个因素对红三叶多糖提取的影响。利用正交试验对提取条件进行优化筛选，确定酶提取方法为：酶解时间90 min，酶用量1.0%，酶解温度60 ℃，酶比例为木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶7∶2∶2，红三叶粗多糖含量为8.85%。本研究比较了酶提取以及文献中超声和热水提取，3种方法所制备红三叶多糖的理化性质和抗氧化活性。3个多糖提取样品均具有抗氧化活性，对O₂^·-自由基的清除活性明显高于阳性对照抗坏血酸。不同多糖提取样品的分子量范围差异明显，以酶提取和热水提取较为集中。3种多糖样品均由8种单糖组成，其中葡萄糖（Glu）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）摩尔占比相对较高，约占到单糖组分的3/4。但单糖比例差异较大，酶提取多糖中Glu摩尔百分比最高，是热水提取多糖的1.6倍，超声提取的1.4倍。

关键词: 红三叶, 多糖, 酶提取, 工艺优化, 抗氧化活性

Abstract:

Red clover （Trifolium pratense） is a resource-rich perennial leguminous forage species that is cultivated worldwide. Its polysaccharide components have good hypoglycemic and antioxidant properties， and have potential applications in the development of new， high-value products. The polysaccharides can be extracted using enzymes， and milder extraction conditions are conducive to retaining their beneficial properties. In this study， the effects of enzymatic hydrolysis time， enzyme dosage， enzyme ratio， and enzymatic hydrolysis temperature on the extraction of red clover polysaccharides were investigated. The extraction conditions were optimized and screened by orthogonal experiments. The results showed that the best enzyme extraction method was as follows： enzymatic hydrolysis time of 90 min， enzyme dosage of 1.0%， enzymatic hydrolysis temperature of 60℃， and enzyme ratio papain∶cellulase∶pectinase of 7∶2∶2. The crude polysaccharide content in red clover was 8.85%. We compared the enzyme extraction method with two other methods； ultrasonic extraction and hot water extraction. Red clover polysaccharides were extracted using all three methods， and their physical and chemical properties and antioxidant activity were compared. All three polysaccharide extracts showed antioxidant activity， with stronger abilities to scavenge O₂^·- free radicals than that of the positive control， vitamin C. The molecular weight ranges of polysaccharide samples prepared using the different extraction methods were significantly different， and the enzyme extract and hot water extract were more concentrated than the ultrasonic extract. The three polysaccharide samples were composed of eight types of monosaccharides， among which glucose， galactose， and arabinose had relatively high molar ratios， accounting for approximately 3/4 of the monosaccharide components. The proportions of monosaccharides varied widely among the samples， and the molar percentage of glucose was highest in the enzyme-extracted polysaccharides （1.6 times that in hot water-extracted polysaccharides and 1.4 times that in ultrasonically extracted polysaccharides）.

Key words: red clover, polysaccharides, enzyme extraction, process optimization, antioxidant activity

祁兆奔, 任晓艳, 李怡彤, 马金云, 刘权. 红三叶多糖的酶提取方法及抗氧化活性研究[J]. 草业学报, 2024, 33(6): 105-115.

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图/表 10

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水平 Levels	A	B	C	D
水平 Levels	酶解时间 Enzymatic hydrolysis time （min）	酶用量 Enzyme dosage （%）	酶解温度 Enzymatic hydrolysis temperature （℃）	酶比例 Enzyme ratio
1	80	0.7	50	3∶1∶1
2	90	0.9	60	7∶2∶2
3	100	1.0	65	4∶1∶1

水平 Levels	A	B	C	D
水平 Levels	酶解时间 Enzymatic hydrolysis time （min）	酶用量 Enzyme dosage （%）	酶解温度 Enzymatic hydrolysis temperature （℃）	酶比例 Enzyme ratio
1	80	0.7	50	3∶1∶1
2	90	0.9	60	7∶2∶2
3	100	1.0	65	4∶1∶1

序号 Serial number	A	B	C	D	多糖含量 Polysaccharides content （%）
序号 Serial number	酶解时间 Enzymatic hydrolysis time （min）	酶用量 Enzyme dosage （%）	酶解温度 Enzymatic hydrolysis temperature （℃）	酶比例 Enzyme ratio	多糖含量 Polysaccharides content （%）
1	1	1	1	1	6.79
2	1	2	2	3	8.83
3	1	3	3	2	6.25
4	2	1	2	2	8.33
5	2	2	3	1	5.84
6	2	3	1	3	8.42
7	3	1	3	3	3.96
8	3	2	1	2	7.24
9	3	3	2	1	8.22
K₁	21.87	19.08	22.45	20.85	—
K₂	22.59	21.91	25.38	21.82	—
K₃	19.42	22.89	16.05	21.21	—
R	3.17	3.81	9.33	0.97	—

序号 Serial number	A	B	C	D	多糖含量 Polysaccharides content （%）
序号 Serial number	酶解时间 Enzymatic hydrolysis time （min）	酶用量 Enzyme dosage （%）	酶解温度 Enzymatic hydrolysis temperature （℃）	酶比例 Enzyme ratio	多糖含量 Polysaccharides content （%）
1	1	1	1	1	6.79
2	1	2	2	3	8.83
3	1	3	3	2	6.25
4	2	1	2	2	8.33
5	2	2	3	1	5.84
6	2	3	1	3	8.42
7	3	1	3	3	3.96
8	3	2	1	2	7.24
9	3	3	2	1	8.22
K₁	21.87	19.08	22.45	20.85	—
K₂	22.59	21.91	25.38	21.82	—
K₃	19.42	22.89	16.05	21.21	—
R	3.17	3.81	9.33	0.97	—

因素 Factors	离差平方和 Sum of squares of deviations	自由度 Degree of freedom	均方 Mean square	F值 F value	显著性 Significance
A	5.553	2	2.777	29.500	P<0.01
B	7.819	2	3.910	41.540	P<0.01
C	45.545	2	22.773	241.940	P<0.01
D	0.474	2	0.237	2.520	P>0.05

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Enzyme extraction method and antioxidant activity of polysaccharides from red clover

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Metrics

样品 Samples	半抑制浓度Semi-inhibitory concentration （mg·mL^-1）
样品 Samples	清除DPPH自由基 Scavenging DPPH free radical	清除O₂^·-自由基 Scavenging superoxide anion free radical
酶提取多糖Enzyme extraction polysaccharides	0.65±0.00a	1.16±0.05b
超声提取多糖Ultrasonic extraction polysaccharides	0.48±0.01b	0.92±0.01c
热水提取多糖Hot water extraction polysaccharides	0.46±0.01b	0.95±0.01c
抗坏血酸Vc	0.02±0.00c	2.01±0.02a

样品 Samples	组分 Components	重均分子量 Weight-average molecular weight （g·mol^-1）	数均分子量 Number-average molecular weight （g·mol^-1）	多分散系数 Polydispersity
酶提取多糖 Enzyme extraction polysaccharides	1	1.66×10⁵	1.23×10⁵	1.35
	2	7.21×10⁴	7.19×10⁴	1.00
	3	6.00×10⁴	5.97×10⁴	1.00
	4	1.57×10⁴	1.50×10⁴	1.05
超声提取多糖 Ultrasonic extraction polysaccharides	1	2.40×10⁵	1.56×10⁵	1.54
	2	6.48×10⁴	6.28×10⁴	1.03
	3	8.89×10³	8.64×10³	1.03
热水提取多糖 Hot water extraction polysaccharides	1	1.82×10⁵	1.49×10⁵	1.22
	2	9.06×10⁴	9.03×10⁴	1.00
	3	7.38×10⁴	7.34×10⁴	1.00
	4	1.87×10⁴	1.79×10⁴	1.04

提取方法 Extraction methods	单糖组成 Monosaccharide composition （摩尔百分比mol%）
提取方法 Extraction methods	甘露糖Man	鼠李糖Rha	葡萄糖醛酸GluA	半乳糖醛酸GalA	葡萄糖 Glu	半乳糖 Gal	木糖 Xyl	阿拉伯糖Ara
酶提取Enzyme extraction	5.09	6.57	3.31	5.05	28.55	27.28	5.84	18.31
超声提取Ultrasonic extraction	5.44	6.62	3.45	3.69	20.92	30.81	6.12	22.95
热水提取Hot water extraction	4.93	7.59	4.02	6.35	17.86	32.95	6.00	20.29

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