硼对根瘤菌胞外多糖和吲哚乙酸分泌的调控研究

doi:10.11686/cyxb2020220

摘要/Abstract

摘要：

为探究硼促进根瘤菌gn5f产胞外多糖和吲哚乙酸的调控机制，采用Label free蛋白质定量技术，分析硼对根瘤菌gn5f差异蛋白表达的影响。结果表明，最适硼浓度为100 mg?L^-1，该浓度可以显著促进根瘤菌gn5f胞外多糖和吲哚乙酸（IAA）的分泌，同时最适浓度处理根瘤菌gn5f共鉴定到54个差异表达蛋白，其中7个上调蛋白，47个下调蛋白。生物信息学分析表明，这些差异蛋白与能量产生及转化，脂肪酸β氧化、糖异生、氨基酸代谢及各种代谢酶类等有关。100 mg?L^-1硼促进根瘤菌gn5f产胞外多糖和IAA的机制为：硼通过促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶、琥珀酸半醛脱氢酶（NADP⁺）等差异蛋白上调，继而促进丙酮酸代谢、γ-氨基丁酸（GABA）旁路代谢，谷氨酸代谢等与三羧酸循环有关的代谢通路，为胞外多糖合成提供能量及所需要的各种前体物质（D-半乳糖残基，D-葡萄糖残基以及D-葡萄糖醛酸等），进而促进胞外多糖的合成；硼促进色氨酸合成，色氨酸在相关酶的作用下经吲哚-3-乙酰胺（IAM）或吲哚-3-丙酮酸途径合成IAA，继而促进IAA的合成。

关键词: 硼, 根瘤菌, 胞外多糖, IAA, 蛋白质组学

Abstract:

The aim of this study was to determine how boron promotes the production of extracellular polysaccharides and indole-3-acetic acid （IAA） by the Rhizobium strain gn5f. A label-free protein quantitative technique was used to analyze the effect of boron on the protein expression of Rhizobium strain gn5f. The results showed that 100 mg?L^-1 was the optimum boron concentration for inducing polysaccharide and IAA production by Rhizobium strain gn5f. A comparison between the control （no boron） and the 100 mg?L^-1boron treatment identified 54 differentially expressed proteins； 7 up-regulated proteins and 47 down-regulated proteins. Bioinformatics analysis showed that these differentially expressed proteins were related to energy production and conversion， fatty acid β-oxidation， gluconeogenesis， amino acid metabolism， and various metabolic processes. The proposed mechanism by which boron promotes the production of extracellular polysaccharides and IAA by Rhizobium gn5f is as follows： boron up-regulates NAD-dependent succinate-semialdehyde dehydrogenase， acetyl-coenzyme A synthetase， and succinate-semialdehyde dehydrogenase （NADP⁺）， which promote metabolic pathways related to the tricarboxylic acid cycle such as pyruvate metabolism， γ-aminobutyric acid （GABA） bypass metabolism， and glutamate metabolism. The energy and various carbohydrates （D-galactose and D-glucose residues， D-glucuronic acid） provided by these metabolic pathways promote the synthesis of extracellular polysaccharides. Finally， IAA is synthesized from tryptophan via indole-3-acetamide （IAM） or indole-3-pyruvate under the action of related enzymes， and boron contributes to this process by improving tryptophan synthesis.

Key words: boron, rhizobia, extracellular polysaccharides, IAA, proteomics

陈永岗, 康文娟, 吴芳, 阿芸, 师尚礼, 张翠梅, 李自立. 硼对根瘤菌胞外多糖和吲哚乙酸分泌的调控研究[J]. 草业学报, 2021, 30(5): 42-51.

Yong-gang CHEN, Wen-juan KANG, Fang WU, Yun A, Shang-li SHI, Cui-mei ZHANG, Zi-li LI. Boron promotes secretion of extracellular polysaccharides and indole-3-acetic acid by Rhizobium[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2021, 30(5): 42-51.

图/表 7

图1 不同硼浓度对根瘤菌gn5f OD600的影响不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05), the same below.

Fig.1 Effects of different boron concentrations on gn5f OD600

图2 硼处理前后根瘤菌gn5f生长曲线

Fig.2 Growth curve of strain gn5f treated by boron before and after

图3 硼对根瘤菌gn5f产胞外多糖和IAA的影响

Fig.3 Effect of boron on extracellular polysaccharides and IAA production of gn5f

图4 SDS-PAGE电泳结果1、2、3表示根瘤菌gn5f未被硼处理的蛋白质电泳图；4、5、6表示根瘤菌gn5f被100 mg·L-1硼处理的蛋白质电泳图。1, 2 and 3 represent protein electrophoresis images of rhizobium gn5f without boron treatment; 4, 5 and 6 represent protein electrophoresis images of rhizobium gn5f with 100 mg·L-1 boron treatment.

Fig. 4 SDS-PAGE electrophoresis results

图5 硼处理根瘤菌gn5f差异表达蛋白GO 功能富集分析

Fig.5 Functional enrichment analysis of boron-treated rhizobium gn5f differentially expressed protein

图6 硼处理根瘤菌gn5f差异表达蛋白KEGG注释统计

Fig.6 KEGG annotation statistics of gn5f differentially expressed protein of boron-treated rhizobium

图7 根瘤菌gn5f差异表达蛋白数量最多的前20个通路A：抗生素合成 Biosynthesis of antibiotics； B：碳代谢 Carbon metabolism； C：赖氨酸降解 Lysine degradation； D：丁酸脂代谢 Butanoate metabolism； E：酪氨酸代谢 Tyrosine metabolism； F：色氨酸代谢 Tryptophan metabolism； G：苯丙氨酸代谢 Phenylalanine metabolism； H：甲烷代谢 Methane metabolism； I：原核生物碳固定代谢 Carbon fixation pathways in prokaryotes； J：乙醛酸和二羧酸代谢 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism； K：丙酸酯代谢 Propanoate metabolism； L：脂肪酸降解 Fatty acid degradation； M： ABC转运蛋白 ABC transporters； N：丙酮酸代谢 Pyruvate metabolism； O：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢 Alanine, aspartate and glutamate metabolism； P：群体感应 Quorum sensing； Q：氮代谢 Nitrogen metabolism； R：脂肪酸代谢 Fatty acid metabolism； S：氨基酸生物合成 Biosynthesis of amino acids； T：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解 Valine, leucine and isoleucine degradation.

Fig.7 Top 20 pathways with the most differentially expressed proteins from rhizobia gn5f

参考文献 39

1	Ma L， Ma S Y， Chen G P， et al. Physiological responses of pea and nodule symbiosis to water stress. Acta Prataculturae Sinica， 2019， 28（9）： 96-109.
	马蕾，马绍英，陈贵平，等. 豌豆与根瘤共生对水分胁迫的生理响应. 草业学报， 2019， 28（9）： 96-109.
2	Ma X， Wang L L， Li W J， et al. Effects of different nitrogen levels on nitrogen fixation and seed production of alfalfa inoculated with rhizobia. Acta Prataculturae Sinica， 2013， 22（1）： 95-102.
	马霞，王丽丽，李卫军，等. 不同施氮水平下接种根瘤菌对苜蓿固氮效能及种子生产的影响. 草业学报， 2013， 22（1）： 95-102.
3	Afzal M， Khan S， Iqbal S， et al. Inoculation method affects colonization and activity of Burkholderia phytofirmans PsJN during phytoremediation of diesel-contaminated soil. International Biodeterioration & Biodegradation， 2013， 85： 331-336.
4	Li J F， Zhang S Q， Shi S L， et al. Position and quantity of endogensis rhizobia in alfalfa plant. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2009， 17（6）： 1200-1205.
	李剑峰，张淑卿，师尚礼，等. 苜蓿内生根瘤菌分布部位与数量变化动态. 中国生态农业学报， 2009， 17（6）： 1200-1205.
5	Li J F， Zhang S Q， Shi S L， et al. Infection and migration of marked rhizobia in alfalfa bud seedlings under the action of exogenous substance. Acta Agrestia Sinica， 2015， 23（6）： 1259-1264.
	李剑峰，张淑卿，师尚礼，等. 几种外源物质对内生根瘤菌侵染苜蓿芽苗并在植株体内运移的影响. 草地学报， 2015， 23（6）： 1259-1264.
6	Wu Y， Xi L Q. Dynamics of IAA produced by nitrogen fixation bacteria around oat root system. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2007， 35（15）： 4424-4425.
	吴瑛，席琳乔. 燕麦根际固氮菌分泌IAA的动态变化研究. 安徽农业科学， 2007， 35（15）： 4424-4425.
7	Dong R， Cao Y R. Research progress on the immune regulation of symbiotic nitrogen fixation between legumes and rhizobia. Biotechnology Bulletin， 2019， 35（10）： 25-33.
	董汝，曹扬荣. 豆科植物-根瘤菌共生固氮的免疫调控机制. 生物技术通报， 2019， 35（10）： 25-33.
8	Jordan J V， Anderson G R. Effect of boron on nitrogen fixation by azotobacter. Soil Science， 1950， 69（4）： 311-320.
9	Ei-hamdaoui A， Redondo N M， Rivilla R， et al. Effects of boron and calcium nutrition on the establishment of the Rhizobium leguminosarum-pea （Pisum sativum） symbiosis and nodule development under salt stress. Plant， Cell & Environment， 2003， 26（7）： 1003-1011.
10	Bonilla I. The aberrant cell walls of boron-deficient bean root nodules have no covalently bound hydroxyproline-proline-rich proteins. Plant Physiology， 1997， 115（4）： 1329-1340.
11	Miao Y Y， Zhou T， Shi S L， et al. Effect of born on migration and colonization by rhizobia and seeding growth in Medicago sativa. Acta Prataculturae Sinica， 2017， 26（4）： 120-133.
	苗阳阳，周彤，师尚礼，等. 硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响. 草业学报， 2017， 26（4）： 120-133.
12	Redondo N M， Rivilla R， Ei H A， et al. Research note： Boron deficiency affects early infection events in the pea-rhizobium symbiotic interaction. Functional Plant Biology， 2001， 28（8）： 819-823.
13	Song B Q， Pei X Y， Yan Z S， et al. Effects of boron on endogenous hormones of sugar beet. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2014， 31（6）： 115-120.
	宋柏权，裴轩瑗，闫志山，等. 硼素对甜菜内源激素的影响研究. 中国农学通报， 2014， 31（6）： 115-120.
14	Yang Y， Gao K X， Wu Y， et al. Indole-3-acetic acid-mediated cross-kingdom signaling involved in plant-bacteria interactions. Biotechnology Bulletin， 2016， 32（8）： 14-21.
	杨扬，高克祥，吴岩，等. 吲哚乙酸跨界信号调节植物与细菌互作. 生物技术通报， 2016， 32（8）： 14-21.
15	Wu J， Li C J， Wang H， et al. Effect of boron deficiency on structure and nitrogenase activity of nodules in soybean plants. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 1999， 19（3）： 439-445.
	吴静，李春俭，王贺，等. 缺硼对大豆根瘤结构和功能的影响. 西北植物学报， 1999， 19（3）： 439-445.
16	Zhang B， Sun B S， Jin M， et al. Extraction and analysis of extracellular polymeric substances in membrane fouling in submerged MBR. Desalination， 2008， 227（1）： 286-294.
17	Zhao D Q， Yao T， Ma W B， et al. Effect of mixture of phosphate solubilizing bacteria and nodule bacteria on alfalfa seedling growth. Chinese Journal of Grassland， 2015， 37（5）： 57-61.
	赵冬青，姚拓，马文彬，等. 溶磷菌和根瘤菌混合菌剂对苜蓿苗期生长的影响. 中国草地学报， 2015， 37（5）： 57-61.
18	Zhang Y Y， Tang H， Guo Y H， et al. Establishment of two-dimensional gel electrophoresis technique for sheep serum. Xinjiang Agricultural Science， 2017， 54（1）： 190-196.
	张译元，唐红，郭延华，等. 绵羊血清蛋白双向凝胶电泳技术的建立. 新疆农业科学， 2017， 54（1）： 190-196.
19	Miao W H， Qu L L， Pang L， et al. Construction， expression， purification and evaluation of diagnostic effects of rubella virus compound epitope peptide. Chinese Journal Clinical Laboratory Science， 2015， 33（12）： 889-894.
	缪卫华，渠利利，庞露，等. 风疹病毒复合多表位肽的构建、表达、纯化及其诊断效能的初步评价. 临床检验杂志， 2015， 33（12）： 889-894.
20	Ma S L， Dong X， Xia X， et al. Impact of Streptococcus sanguis bacteriocins on the growth curve and intracellular free calcium concentration of Porphyromonas gingivalis. Journal of Oral Science Research， 2014， 30（2）： 108-111.
	马晟利，董雪，夏雪，等. 血链球菌细菌素对牙龈卟啉单胞菌生长曲线及细胞内钙离子浓度的影响. 口腔医学研究， 2014， 30（2）： 108-111.
21	Chai R J， Wang Y L. Effect of REE on growth of bacteria and fluorescence spectrum of DNA. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2013， 33（7）： 1829-1833.
	柴瑞娟，王玉良. 镧和铈对两种细菌生长的影响及胞内DNA的荧光光谱分析. 光谱学与光谱分析， 2013， 33（7）： 1829-1833.
22	Montanari C， Kamdem S L S， Serrazanetti D I， et al. Synthesis of cyclopropane fatty acids in Lactobacillus helveticus and Lactobacillus sanfranciscensis and their cellular fatty acids changes following short term acid and cold stresses. Food Microbiology， 2010， 27（4）： 493-502.
23	Kabu M， Uyarlar C， Zarczynska K， et al. The role of boron in animal health. Journal of Elementology， 2015， 20（2）： 535-541.
24	Zhang W W. Calmodulin-like-protein in prokaryotes. Progress in Biochemistry and Biophysic， 1995， 22（2）： 98-102.
	张蔚文. 原核生物中的类钙调蛋白. 生物化学与生物物理进展， 1995， 22（2）： 98-102.
25	Redondo N M， Wilmot A R， Ei H A， et al. Relationship between boron and calcium in the N₂-fixing legume-rhizobia symbiosis. Plant， Cell and Environment， 2003， 26（11）： 1905-1915.
26	Zhang S Q， Li J F， Shi S L， et al. Quantity and ecological dominance of endogenesis rhizobia in bud seedling and seeds of alfalfa. Chinese Journal of Grassland， 2009， 31（5）： 90-95.
27	Martin S， Dominic T N， Patrick C. Influence of boric acid on energy metabolism and stress tolerance of Candida albicans. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology， 2018， 49： 140-145.
28	Qin G， Zong Y， Chen Q， et al. Inhibitory effect of boron against Botrytis cinerea on table grapes and its possible mechanisms of action. International Journal of Food Microbiology， 2010， 138（1/2）： 145-150.
29	Mustafa K， Cangir U U， Katarzyna Z， et al. The role of boron in animal health. Journal of Elementology， 2015， 20（2）： 535-541.
30	Hu H， Zhang R B， Qin J M， et al. Enzymatic characterization of acetyl CoA synthetase and its application in biosynthesis of mevalonate. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2016， 22（3）： 357-362.
	胡红，张汝兵，秦杰明，等. 乙酰辅酶A合成酶的酶学性质及其在甲羟戊酸合成中的应用. 应用与环境生物学报， 2016， 22（3）： 357-362.
31	Wang L H， Yang Z W， Zhu L， et al. Cloning and prokaryotic expression of sweet sorghum succinic semialdehyde dehydrogenase SbSSADH. Biotechnology Bulletin， 2015， 31（7）： 83-90.
	王龙海，杨泽伟，朱莉，等. 甜高粱琥珀酸半醛脱氢酶SbSSADH基因克隆及原核表达. 生物技术通报， 2015， 31（7）： 83-90.
32	Sànchez M， Alvarez M A， Balana R， et al. Properties and functions of two succinic-semialdehyde dehydrogenases from Pseudomonas putida. Biochim Biophys Acta， 1988， 953（3）： 249-257.
33	Peter W， Hermann H. Substrate stereochemistry of the enoyl-CoA hydratase reaction. European Journal of Biochemistry， 1975， 54（1）： 247-252.
34	Xiao B C， Rong X H， Qin L Y， et al. Theoretical study on the chemical mechanism of enoyl-CoA hydratase and the form of inhibitor binding. Journal of Molecular Modeling， 2014， 20（9）： 2411-2422.
35	Zhang D， Liu Z X， Choi C S， et al. Mitochondrial dysfunction due to long-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency causes hepatic steatosis and hepatic insulin resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2007， 104（43）： 17075-17080.
36	Tang D J， He Y Q， Feng J X， et al. Xanthomonas campestris pv. campestris possesses a single gluconeogenic pathway that is required for virulence. Journal of Bacteriology， 2005， 187（17）： 6231-6237.
37	Wang W W， Guan D W， Ma M C， et al. Genetic diversity and phylogeny of soybean rhizobia isolated from Northeast China. Soybean Science， 2013， 32（4）： 433-437.
	王卫卫，关大伟，马鸣超，等. 东北地区大豆根瘤菌遗传多样性与系统发育研究. 大豆科学， 2013， 32（4）： 433-437.
38	Wang X F. The proteomics research of tap root inflation in sugar beet （Beta vulgaris L.） by iTRAQ. Huhhot： Inner Mongolia Agriculture University， 2016.
	王雪峰. 基于iTRAQ技术对甜菜块根膨大蛋白质组学的研究. 呼和浩特：内蒙古农业大学， 2016.
39	Janczarek M. Environmental signals and regulatory pathways that influence exopolysaccharide production in rhizobia. International Journal of Molecular Sciences， 2011， 12（12）： 7898-7933.

[1]	魏志敏, 孙斌, 方成, 代子雯, 刘满强, 焦加国, 胡锋, 李辉信, 徐莉. 根瘤菌与固氮菌联合对毛叶苕子的促生效果[J]. 草业学报, 2021, 30(5): 94-102.
[2]	邢易梅, 蕫理, 战力峰, 才华, 杨圣秋, 孙娜. 混合接种摩西球囊霉和根瘤菌对紫花苜蓿耐碱能力的影响[J]. 草业学报, 2020, 29(9): 136-145.
[3]	何国兴, 宋建超, 温雅洁, 刘彩婷, 祁娟. 不同根瘤菌肥对紫花苜蓿生产力及土壤肥力的综合影响[J]. 草业学报, 2020, 29(5): 109-120.
[4]	康文娟, 师尚礼, 苗阳阳. 紫花苜蓿根瘤菌分子分型和生物型划分研究[J]. 草业学报, 2019, 28(2): 88-101.
[5]	严警, 夏丽, 盛下放, 何琳燕. 耐重金属苜蓿中华根瘤菌的筛选及其与能源植物联合富集铜的特性[J]. 草业学报, 2019, 28(2): 102-111.
[6]	郑春风, 刘春增, 李本银, 吕玉虎, 潘兹亮, 曹卫东. 叶面喷硼对紫云英结实特性的影响[J]. 草业学报, 2019, 28(11): 192-199.
[7]	刘明, 陈远学, 陈强, 彭丹, 喻晓, 杨军伟, 徐开未. 翻压接种根瘤菌的紫花苕子对植烟土壤肥力的影响[J]. 草业学报, 2019, 28(1): 162-169.
[8]	谢志坚, 周春火, 贺亚琴, 宋涛, 于洋, 吴佳. 21世纪我国稻区种植紫云英的研究现状及展望[J]. 草业学报, 2018, 27(8): 185-196.
[9]	赵涛,马春晖,王栋,景永元,席琳乔. 冬小麦套种草木樨土壤中根瘤菌分布与土壤理化性质的相关性分析[J]. 草业学报, 2018, 27(4): 45-55.
[10]	王登科, 于翔宇, 张学风, 黄蕾, 李晓婷, 贺治斌, 康林, 王党军, 姚露花, 郭彦军. 酸、铝和盐胁迫对夏季豆科绿肥作物种子萌发及根瘤菌抗氧化酶活性的影响[J]. 草业学报, 2018, 27(10): 35-44.
[11]	舒健虹, 王普昶, 李显刚, 王小利, 李小冬. 无机磷溶解菌的分离筛选及其对扁穗雀麦生长的影响[J]. 草业学报, 2017, 26(5): 173-180.
[12]	苗阳阳, 周彤, 师尚礼, 康文娟, 张运婷. 硼对根瘤菌在紫花苜蓿体内运移和定殖及对幼苗生长的影响[J]. 草业学报, 2017, 26(4): 120-133.
[13]	曾庆飞, 王茜, 陆瑞霞, 刘正书, 吴佳海, 王小利. 大豆根际促生菌的分离筛选及其对大豆和百脉根生长与品质的影响[J]. 草业学报, 2017, 26(1): 99-111.
[14]	何树斌, 郭理想, 李菁, 王燚, 刘泽民, 程宇阳, 呼天明, 龙明秀. 丛枝菌根真菌与豆科植物共生体研究进展[J]. 草业学报, 2017, 26(1): 187-194.
[15]	王雪翠, 马晓彤, 韩梅, 曹卫东, 张宏亮, 白金顺, 曾闹华, 高嵩涓, 周国朋, 王艳秋. 青海箭筈豌豆根瘤菌的筛选及其共生体耐盐性研究[J]. 草业学报, 2016, 25(8): 145-153.