豌豆蚜组织蛋白酶K基因（ApCtsk1）的鉴定及功能研究

doi:10.11686/cyxb2024147

摘要/Abstract

摘要：

为探究豌豆蚜ApCtsk1基因的生理功能，评估其作为豌豆蚜防治靶标的潜力，从而为防控策略的制定提供理论依据。本研究以豌豆蚜为对象，利用NCBI、ExPASy Proteomics Server、MEGA 11等在线网站和软件分析ApCtsk1的氨基酸序列特征并构建系统发育树；采用RT-qPCR技术解析其在不同发育阶段、不同组织的表达模式；通过RNAi研究ApCtsk1在豌豆蚜个体发育和繁殖中的生物学功能。结果表明：豌豆蚜ApCtsk1与半翅目蚜科昆虫的半胱氨酸蛋白酶聚为一支，其在4龄若蚜期显著高表达，并在成虫腹部、卵巢、表皮表达量较高。RNAi干扰3龄若蚜的ApCtsk1后，与对照组相比，豌豆蚜死亡率升高至22.22%，体长体宽分别减小12.56%、13.22%，体色异常，行动缓慢。此外，经dsApCtsk1处理的蚜虫出现蜕皮失败的致死现象，且干扰后豌豆蚜繁殖力也受到影响，表现为产蚜时间的推迟和一段时间产蚜量的降低。由此可见，ApCtsk1在豌豆蚜个体发育、存活和繁殖过程中具有重要的作用。

关键词: 豌豆蚜, 组织蛋白酶K, 繁殖, RNAi

Abstract:

The aim of this research was to explore the function of ApCtsk1 in pea aphid （Acyrthosiphon pisum） and evaluate its potential as a target for the prevention and control of this pest. The amino acid sequence characteristics of the putative ApCtsk1 protein were analyzed using tools at various websites （NCBI， ExPASy Proteomics Server） and a phylogenetic tree was constructed using MEGA 11. The transcript levels of its encoding gene were determined in aphids at different stages of development and in different tissues by RT-qPCR analysis. The biological function of ApCtsk1 in the development and reproduction of A. pisum was investigated using an RNA interference gene knock-down strategy. In the phylogenetic analysis， ApCtsk1 was clustered with cysteine proteases from other members of the Aphididae in the Hemiptera. High transcript levels of ApCtsk1 were detected in fourth instar nymphs， and in the abdomen， ovary， and cuticle of adult aphids. Compared with A. pisum in the control group， those in the ApCtsk1-knockdown group showed an increased mortality rate （22.22% higher）， decreased body length and body width （decreased by 12.56% and 13.22%， respectively）， abnormal body color， and slower movement. In addition， the aphids with knocked-down ApCtsk1 showed the lethal phenomenon of molting failure， which affected their fecundity. These changes resulted in delayed reproduction and decreased reproduction over time. Our findings show that ApCtsk1 plays an important role in the development， survival， and reproduction of A. pisum.

Key words: Acyrthosiphon pisum, cathepsin K, fecundity, RNAi

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图/表 6

表1 豌豆蚜ApCtsk1基因qPCR的引物序列

Table 1 Primer sequence of qPCR for ApCtsk1 gene of A. pisum

基因

名称

Gene name

引物序列

Primer sequence （5′-3′）

产物

大小

Product size （bp）

扩增效率

Amplification efficiency （%）

EF1α

CTGTGCTTATTGTCGCTGCT

TCGCTGTATGGTGGTTCAGT

157

108.25

RPL7

TTGAAGAGCGTAAGGGAACTG

TATTGGTGATTGGAATGCGTTG

97.89

ApCtsk1

ACTGGTACCATCGAAGGAGC

GCCATGCTTCTCAATCCAAGA

153

101.71

表2 dsRNA引物

Table 2 dsRNA primers

基因 Gene	引物方向 Primer direction （5′-3′）	核苷酸序列 Nucleotide sequence （5′-3′）	产物长度 Product size （bp）
dsGFP	上游Forward	TAATACGACTCACTATAGGGCAGTTCTTGTTGAATTAGATG	436
	下游Reverse	TAATACGACTCACTATAGGGTTTGGTTTGTCTCCCATGATG	436
dsApCtsk1	上游Forward	TAATACGACTCACTATAGGGTGAATCTTTCCCTGGACCTGG	541
	下游Reverse	TAATACGACTCACTATAGGGATTGCCAAAACCCCAACTGC	541

图1 豌豆蚜ApCtsk1蛋白的二级结构、三级结构、结构域预测

Fig.1 Prediction of secondary structure， tertiary structure and domain of ApCtsk1 protein in A. pisum

图2 豌豆蚜组织蛋白酶K的系统发育分析

Fig.2 Phylogenetic analysis of cathepsin K protein in A. pisum

图3 豌豆蚜不同发育阶段、不同组织的ApCtsk1表达量A：ApCtsk1在豌豆蚜不同龄期的表达量；B：ApCtsk1在豌豆蚜成蚜不同组织的表达量；不同字母表示差异显著（P<0.05）。A： The expression level of ApCtsk1 in different instars of A. pisum； B： The expression level of ApCtsk1 in different tissues of adult A. pisum； Different letters indicate significant differences at the 0.05 level.

Fig.3 The expression of ApCtsk1 in different developmental stages and different tissues of A. pisum

图4 RNAi ApCtsk1处理后对豌豆蚜的影响A：豌豆蚜ApCtsk1的沉默效率；B：RNAi ApCtsk1对豌豆蚜死亡数的影响；C：RNAi ApCtsk1对豌豆蚜体长、体宽的影响；D：RNAi ApCtsk1处理后豌豆蚜出现的致死表型，a经dsGFP处理，b经dsApCtsk1处理；E：RNAi ApCtsk1对豌豆蚜单日平均产蚜力的影响。相对表达量和体长体宽采用独立样本T检验进行差异显著性分析，*表示显著差异（P<0.05），**表示极显著差异（P<0.01），***表示极其显著差异（P<0.001）。死亡数和平均产蚜数采用单因素方差分析，不同字母表示差异显著（P<0.05）。A： The silencing efficiency of ApCtsk1； B： The effect of RNAi ApCtsk1 on the death count of A. pisum； C： The effect of RNAi ApCtsk1 on the body length and body width of A. pisum； D： The lethal phenotype of A. pisum after RNAi ApCtsk1， a， treated with dsGFP， b， treated with dsApCtsk1； E： Effects of RNAi ApCtsk1 on the average daily fecundity of A. pisum. The relative expression and body length and body width were analyzed by independent sample T-test， * represents significant difference （P<0.05）， ** represents extremely significant difference （P<0.01）， *** represents extremely significant difference （P<0.001）. The number of deaths and the average number of aphids were analyzed by one-way analysis of variance， and different letters indicated significant differences （P<0.05）.

Fig.4 The effect of RNAi ApCtsk1 on A. pisum

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