Identification， bioinformatics analysis of AP2 subfamily genes and MsBBM gene cloning in alfalfa

doi:10.11686/cyxb2025302

Abstract

Abstract:

The AP2 subfamily transcription factors belong to the AP2/ERF superfamily and are involved in regulating various biological processes related to plant growth and development. However， there have been no reports to our knowledge on the AP2 subfamily or BBM genes in alfalfa （Medicago sativa）. In this study， based on whole-genome data of M. sativa， ten AP2 genes were identified using HMMER， among which only one was a BBM gene. Bioinformatics and expression analyses were conducted on the ten AP2 members. The results showed that all AP2 members were unstable， hydrophilic， non-secretory proteins with diverse physicochemical properties and specific secondary and tertiary structures. Motif analysis revealed that AP2 genes were conserved and contain characteristic domains； For instance， only the BBM gene possesses the bbm-1 domain. Additionally， the promoter regions of these genes contained various cis-acting elements related to growth and development， plant hormone responses， and both biotic and abiotic stress responses， indicating that MsAP2 members may play roles in regulating plant development and stress adaptation. Expression pattern analysis by qRT-PCR further demonstrated that MsAP2 genes exhibit tissue-specific and diverse expression profiles， suggesting their potential functions in the growth and development of alfalfa. Further cloning of the MsBBM gene confirmed that its encoded protein is localized in the nucleus. These findings provide a reference for future investigations into the roles of AP2 subfamily genes in the growth and development of alfalfa， and lay a foundation for elucidating the function of the MsBBM gene.

Key words: alfalfa, AP2 transcription factor, BBM gene, growth and development, stress response

Fen-qi CHEN, Jin-qing ZHANG, Yi-jian YU, Zhen-yu LI. Identification， bioinformatics analysis of AP2 subfamily genes and MsBBM gene cloning in alfalfa[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2026, 35(7): 117-134.

Figures/Tables 15

References 45

[1]	Gu C， Guo Z H， Hao P P， et al. Multiple regulatory roles of AP2/ERF transcription factor in angiosperm. Botanical Studies， 2017， 58（1）： 6.
[2]	Feng K， Hou X L， Xing G M， et al. Advances in AP2/ERF super-family transcription factors in plant. Critical Reviews in Biotechnology， 2020， 40（6）： 750-776.
[3]	Chen Y， Sun M Z， Jia B W， et al. Research progress regarding the function and mechanism of rice AP2/ERF transcription factor in stress response. Acta Agronomica Sinica， 2022， 48（4）： 781-790.
	陈悦，孙明哲，贾博为，等. 水稻AP2/ERF转录因子参与逆境胁迫应答的分子机制研究进展. 作物学报， 2022， 48（4）： 781-790.
[4]	Ouakfaoui S E， Schnell J， Abdeen A， et al. Control of somatic embryogenesis and embryo development by AP2 transcription factors. Plant Molecular Biology， 2010， 74（4）： 313-326.
[5]	Tian M K， Xu Z X， Liu X Q， et al. Identification of the AP2 subfamily transcription factors in Chimonanthus praecox and the functional study of CpAP2-L11. Acta Horticulturae Sinica， 2023， 50（2）： 382-396.
	田明康，徐智祥，刘秀群，等. 蜡梅AP2亚家族转录因子鉴定及CpAP2-L11功能研究. 园艺学报， 2023， 50（2）： 382-396.
[6]	Xie Z， Nolan T M， Jiang H， et al. AP2/ERF transcription factor regulatory networks in hormone and abiotic stress responses in Arabidopsis. Frontiers in Plant Science， 2019， 10： 228.
[7]	Yu Y， Duan X B， Ding X D， et al. A novel AP2/ERF family transcription factor from Glycine soja， GsERF71， is a DNA binding protein that positively regulates alkaline stress tolerance in Arabidopsis. Plant Molecular Biology， 2017， 94（415）： 509-530.
[8]	Wang J D， Zhou Y， Yu J W， et al. Advances in the regulation of plant growth and development and stress response by miR172-AP2 module. Chinese Bulletin of Botany， 2020， 55（2）： 205-215.
	王劲东，周豫，余佳雯，等. miR172-AP2模块调控植物生长发育及逆境响应的研究进展. 植物学报， 2020， 55（2）： 205-215.
[9]	Shao C Y， Gao Z， Sun M， et al. The drought-responsive wheat AP2/ERF transcription factor TaRAP2-13L and its interacting protein TaWRKY10 enhance drought tolerance in transgenic Arabidopsis and wheat （Triticum aestivum L.）. International Journal of Biological Macromolecules， 2025， 309（Pt 4）： 143008.
[10]	Hussein A， Abdelsattar M， Radwan K H， et al. Streamlining the defense mechanism involving miRNA/mRNA and phytohormones during mycorrhiza-Fusarium infecting tomato roots. Brazilian Journal of Biology， 2025， 84： e280450.
[11]	Zhong J Q， Situ J J， He C C， et al. A virulent milRNA of Fusarium oxysporum f. sp. cubense impairs plant resistance by targeting banana AP2 transcription factor coding gene MaPTI6L. Horticulture Researchs， 2024， 12（4）： uhae361.
[12]	Xing H W， Wang H， Huang Y Y， et al. FZP modulates tillering via OsMADS57 in rice. Plant Biotechnology Journal， 2025， 23（4）： 1202-1212.
[13]	Li W H， Zhang W H， Li H W， et al. Overexpression of a Fragaria×ananassa AP2/ERF transcription factor gene （FaTINY2） increases cold and salt tolerance in Arabidopsis thaliana. International Journal of Molecular Sciences， 2025， 26（5）： 2109.
[14]	Chen B J， Maas L， Figueiredo D， et al. BABY BOOM regulates early embryo and endosperm development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2022， 119（25）： e2201761119.
[15]	Wang T T， Hu J， Jiao H H， et al. Effect of BBM gene on callus growth and ginsenoside content in Panax quinquefolius. China Journal of Chinese Materia Medica， 2023， 48（12）： 3156-3161.
	王腾腾，胡进，焦红红，等. BBM基因对西洋参愈伤组织生长及人参皂苷含量的影响. 中国中药杂志， 2023， 48（12）： 3156-3161.
[16]	Li P， Xue H W. Structural characterization and expression pattern analysis of the rice PLT gene family. Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 2011， 43（9）： 688-697.
[17]	Li M， Wrobel-Marek J， Heidmann I， et al. Auxin biosynthesis maintains embryo identity and growth during BABY BOOM-induced somatic embryogenesis. Plant Physiology， 2011， 188（2）： 1095-1110.
[18]	Zhang J J， Hao Z D， Ruan X X， et al. Role of BABY BOOM transcription factor in promoting somatic embryogenesis and genetic transformation in a woody Magnoliid liriodendron. Plant， Cell & Environment， 2025， 48（7）： 4859-4872.
[19]	Ji Y J， Xiong J， Qiu X J， et al. Progress on plant parthenogenesis： promoting the application of synthetic apomixis. Hereditas， 2025， 47（4）： 448-455.
	姬亚捷，熊杰，邱先进，等. 植物孤雌生殖研究进展：助力无融合生殖走向应用. 遗传， 2025， 47（4）： 448-455.
[20]	Chen J J， Tomes S， Gleave A P， et al. Significant improvement of apple （Malus domestica Borkh.） transgenic plant production by pre-transformation with a BABY BOOM transcription factor. Horticulture Research， 2022， 9： DOI： 10.1093/hr/uhab014.
[21]	Li X H. TaBBM genes regulate plant regeneration and grain size in common wheat. Tai’an： Shandong Agricultural University， 2021.
	李晓慧. TaBBM基因调控小麦植株再生和籽粒大小的机理研究. 泰安：山东农业大学， 2021.
[22]	Chen H T， Zeng Y， Yang Y Z， et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa. Nature Communications， 2020， 11（1）： 2494.
[23]	Jin X Y， Yin X F， Ndayambaza B， et al. Genome-wide identification and expression profiling of the ERF gene family in Medicago sativa L. under various abiotic stresses. DNA Cell Biology， 2019， 38（10）： 1056-1068.
[24]	Wen X Y， Zhao Y， Wang B Q， et al. Expression analysis of AP2/ERFs genes in alfalfa regulated by exogenous NO under drought stress. Acta Prataculturae Sinica， 2025， 34（6）： 154-167.
	温小月，赵颖，王宝强，等. 外源NO调控干旱胁迫下紫花苜蓿AP2/ERFs基因的表达分析. 草业学报， 2025， 34（6）： 154-167.
[25]	Shu Y J， Liu Y， Zhang J， et al. Genome-wide analysis of the AP2/ERF superfamily genes and their responses to abiotic stress in Medicago truncatula. Frontiers in Plant Science， 2016， 6： 1247.
[26]	Yang X J. Analysis of the copy number of exogenous genes in transgenic cotton using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method. African Journal of Biotechnology， 2012， 11（23）： 6226-6233.
[27]	Nakano T， Suzuki K， Fujimura T， et al. Genome-wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant Physiology， 2006， 140（2）： 411-432.
[28]	Huang X， Ke X N， Hu H C， et al. Genome-wide identification and characterization of the AP2 gene family in Oryza sativa. Molecular Plant Breeding， 2021， 19（11）： 3489-3498.
	黄霞，柯笑楠，胡海超，等. 全基因组鉴定和分析水稻AP2基因家族. 分子植物育种， 2021， 19（11）： 3489-3498.
[29]	Zhang S T， Zhu C， Lyu Y M， et al. Genome-wide identification， molecular evolution， and expression analysis provide new insights into the APETALA2/ethylene responsive factor （AP2/ERF） superfamily in Dimocarpus longan Lour. BMC Genomics， 2020， 21（1）： 62.
[30]	Li M Y， Wang F， Jiang Q， et al. Genome-wide analysis of the distribution of AP2/ERF transcription factors reveals duplication and elucidates their potential function in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis）. Plant Molecular Biology， 2013， 31： 1002-1011.
[31]	Han X W， Han S， Hu Y F， et al. Genome-wide identification of AP2/ERF gene family in Alternanthera philoxeroides and its expression patterns under herbicide stresses. Scientia Agricultura Sinica， 2023， 56（20）： 4021-4034.
	韩晓文，韩硕，胡义锋，等. 喜旱莲子草AP2/ERF基因家族的鉴定及其在除草剂胁迫下的表达模式. 中国农业科学， 2023， 56（20）： 4021-4034.
[32]	Hu Y L， Huang Y Q， Wang T C， et al. Genome-wide identification and expression analysis of AP2/ERF transcription factor family in Baphicacanthus cusia. Plant Physiology Journal， 2024， 60（9）： 1461-1474.
	胡永乐，黄杨钦，王天才，等. 马蓝AP2/ERF转录因子家族全基因组鉴定与表达分析. 植物生理学报， 2024， 60（9）：1461-1474.
[33]	Qiao Y G， Chen L， Cui F F， et al. Bioinformatics and expression analysis of AP2 gene family based on transcriptome of Lonicera japonica Thunb. Journal of Nuclear Agricultural Sciences， 2019， 33（9）： 1698-1706.
	乔永刚，陈亮，崔芬芬，等. 基于转录组金银花AP2基因家族的生物信息学及表达分析. 核农学报， 2019， 33（9）： 1698-1706.
[34]	Zhang Q， Zhou W， Li B， et al. Genome-wide analysis and the expression pattern of the ERF gene family in Hypericum perforatum. Plants， 2021， 10（1）： 133.
[35]	Cui Y， Cao Q， Li Y P， et al. Advances in cis-element and natural variation-mediated transcriptional regulation and applications in gene editing of major crops. Journal of Experimental Botany， 2023， 74（18）： 5441-5457.
[36]	Krizek B. AINTEGUMENTA and AINTEGUMENTA-LIKE6 act redundantly to regulate Arabidopsis floral growth and patterning. Plant Physiology， 2009， 150（4）： 1916-1929.
[37]	Aida M， Beis D， Heidstra R， et al. The PLETHORA genes mediate patterning of the Arabidopsis root stem cell niche. Cell， 2004， 119（1）： 109-120.
[38]	Galinha C， Hofhuis H， Luijten M， et al. PLETHORA proteins as dose-dependent master regulators of Arabidopsis root development. Nature， 2007， 449（7165）： 1053-1057.
[39]	Krizek B A. AINTEGUMENTA-LIKE genes have partly overlapping functions with AINTEGUMENTA but make distinct contributions to Arabidopsis thaliana flower development. Journal of Experimental Botany， 2015， 66（15）： 4537-4549.
[40]	Chen W， Zhou Y Y， Luo P， et al. Molecular mechanism of petal doubling of flower in angiosperm. Chinese Bulletin of Botany， 2024， 59（2）： 257-277.
	陈雯，周颖盈，罗平，等. 被子植物花朵重瓣化分子调控机制. 植物学报， 2024， 59（2）： 257-277.
[41]	Liu Y L， Fan J Y， Chen X F， et al. Preliminary study on the role of OsAP2-4 in regulating rice tillers development. Plant Physiology Journal， 2022， 58（5）： 817-824.
	刘宜林，范均怡，陈晓菲，等. OsAP2-4调控水稻分蘖功能的初步研究. 植物生理学报， 2022， 58（5）： 817-824.
[42]	Kong Q， Low P M， Lim A R Q， et al. Functional antagonism of WRI1 and TCP20 modulates GH3.3 expression to maintain auxin homeostasis in roots. Plants， 2022， 11（3）： 454.
[43]	Li J P， Chen F J， Li Y Q， et al. ZmRAP2.7， an AP2 transcription factor， is involved in maize brace roots development. Frontiers in Plant Science， 2019， 10： 820.
[44]	Krizek B A， Bantle A T， Heflin J M， et al. AINTEGUMENTA and AINTEGUMENTA-LIKE6 directly regulate floral homeotic， growth， and vascular development genes in young Arabidopsis flowers. Journal of Experimental Botany， 2021， 72（15）： 5478-5493.
[45]	Gil-Humanes J， Pistón F， Martín A， et al. Comparative genomic analysis and expression of the APETALA2-like genes from barley， wheat， and barley-wheat amphiploids. BMC Plant Biology， 2009， 9： 66.

引物名称 Primer name	基因ID Gene ID	正向引物 Forward primer （5′-3′）	反向引物 Reverse primer （5′-3′）	试验类别 Experiment category
MsBBM	MsG0780039855.01	ATGAACAACAACAACCAACAAGC	TTCATGCAACAAAGTGAAAGGAG	基因克隆Gene cloning
P-MsBBM	MsG0780039855.01	AGAAGACGTTCCAACCACGT	CGGTAAGGATCTGAGCTACACA	阳性克隆鉴定Positive clone identification
pCEGFP-BBM	MsG0780039855.01	ATGAACAACAACAACCAACAAGC	TTCATGCAACAAAGTGAAAGGAGG	亚细胞定位Subcellular localization
qMsBBM	MsG0780039855.01	GGCAGCGGAGGCATATGA	CGTTTTGCAGCACCACCA	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-1	MsG0280011046.01	TGGTGAACATGCAGCGGA	AAGCATCTGCACCCGACC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-2	MsG0380017239.01	GTGGAGCTGGTGGTGGTT	CCAGGGCTCATTGAAAGGC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-3	MsG0480021078.01	CAGAGGACTCAACGCCGT	TGCAGCTCCTCCTCCGAT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-4	MsG0680030730.01	TGCAAGGCACCACCACAA	GCACGAGCAGCTTCCTCT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-5	MsG0880042725.01	TTCTCAGCCGCCTCCTCT	TGCTTGGTGAACCGTGCT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-6	MsG0880043914.01	CGTGGGGTTGCTAGGCAT	TGCCATTGCTGCCTCCTC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-7	MsG0880043916.01	AACATCCCTTGGCCGTGG	AGCTAACAGTGCCGGCTG	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-8	MsG0880046012.01	TGGAAGATGGCAAGCTCGA	GGCTTCAGCTGCTTCCTCT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-9	MsG0880047564.01	GCATCACACTCGCTCGGA	CTCCGCATGCAAGCAACC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
Actin	MsG0780037052.01	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR

引物名称 Primer name	基因ID Gene ID	正向引物 Forward primer （5′-3′）	反向引物 Reverse primer （5′-3′）	试验类别 Experiment category
MsBBM	MsG0780039855.01	ATGAACAACAACAACCAACAAGC	TTCATGCAACAAAGTGAAAGGAG	基因克隆Gene cloning
P-MsBBM	MsG0780039855.01	AGAAGACGTTCCAACCACGT	CGGTAAGGATCTGAGCTACACA	阳性克隆鉴定Positive clone identification
pCEGFP-BBM	MsG0780039855.01	ATGAACAACAACAACCAACAAGC	TTCATGCAACAAAGTGAAAGGAGG	亚细胞定位Subcellular localization
qMsBBM	MsG0780039855.01	GGCAGCGGAGGCATATGA	CGTTTTGCAGCACCACCA	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-1	MsG0280011046.01	TGGTGAACATGCAGCGGA	AAGCATCTGCACCCGACC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-2	MsG0380017239.01	GTGGAGCTGGTGGTGGTT	CCAGGGCTCATTGAAAGGC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-3	MsG0480021078.01	CAGAGGACTCAACGCCGT	TGCAGCTCCTCCTCCGAT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-4	MsG0680030730.01	TGCAAGGCACCACCACAA	GCACGAGCAGCTTCCTCT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-5	MsG0880042725.01	TTCTCAGCCGCCTCCTCT	TGCTTGGTGAACCGTGCT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-6	MsG0880043914.01	CGTGGGGTTGCTAGGCAT	TGCCATTGCTGCCTCCTC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-7	MsG0880043916.01	AACATCCCTTGGCCGTGG	AGCTAACAGTGCCGGCTG	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-8	MsG0880046012.01	TGGAAGATGGCAAGCTCGA	GGCTTCAGCTGCTTCCTCT	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
qMsAP2-9	MsG0880047564.01	GCATCACACTCGCTCGGA	CTCCGCATGCAAGCAACC	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR
Actin	MsG0780037052.01	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG	定量实时荧光逆转录聚合酶链式反应qRT-PCR

基因名 Gene name	氨基酸数目 Number of amino acid	分子量 Molecular weight （Da）	理论等电点 Theoretical isoelectric point	不稳定性指数 Instability index	脂肪指数 Aliphatic index	疏水性系数 Grand average of hydropathicity
MsBBM	590	65160.04	6.43	42.72	56.75	-0.840
MsAP2-1	517	57501.91	5.60	44.77	60.06	-0.759
MsAP2-2	664	73121.27	6.65	51.20	56.14	-0.747
MsAP2-3	526	58996.41	5.66	43.41	52.32	-0.881
MsAP2-4	370	42048.77	8.69	51.89	57.03	-0.858
MsAP2-5	579	64194.62	6.58	45.54	57.60	-0.780
MsAP2-6	388	44099.97	5.63	58.60	61.62	-0.889
MsAP2-7	892	99767.58	5.37	53.23	69.54	-0.641
MsAP2-8	655	73416.14	6.54	56.94	59.15	-0.770
MsAP2-9	610	68181.84	7.14	42.76	79.61	-0.312

基因名 Gene name	氨基酸数目 Number of amino acid	分子量 Molecular weight （Da）	理论等电点 Theoretical isoelectric point	不稳定性指数 Instability index	脂肪指数 Aliphatic index	疏水性系数 Grand average of hydropathicity
MsBBM	590	65160.04	6.43	42.72	56.75	-0.840
MsAP2-1	517	57501.91	5.60	44.77	60.06	-0.759
MsAP2-2	664	73121.27	6.65	51.20	56.14	-0.747
MsAP2-3	526	58996.41	5.66	43.41	52.32	-0.881
MsAP2-4	370	42048.77	8.69	51.89	57.03	-0.858
MsAP2-5	579	64194.62	6.58	45.54	57.60	-0.780
MsAP2-6	388	44099.97	5.63	58.60	61.62	-0.889
MsAP2-7	892	99767.58	5.37	53.23	69.54	-0.641
MsAP2-8	655	73416.14	6.54	56.94	59.15	-0.770
MsAP2-9	610	68181.84	7.14	42.76	79.61	-0.312

基因名 Gene name	亚细胞定位 Subcellular localization	蛋白磷酸化位点Protein phosphorylation sites			二级结构Secondary structure
基因名 Gene name	亚细胞定位 Subcellular localization	丝氨酸 Serine	苏氨酸 Threonine	酪氨酸 Tyrosine	α螺旋 Alpha helix （%）	延伸链 Extended strand （%）	无规则卷曲 Random coil （%）
MsBBM	细胞核Nucleus	39	23	11	15.93	4.92	79.15
MsAP2-1	细胞核Nucleus	28	17	13	14.89	3.68	81.43
MsAP2-2	细胞核Nucleus	66	24	10	14.16	5.42	80.42
MsAP2-3	细胞核Nucleus	40	16	11	15.78	5.13	79.09
MsAP2-4	细胞核Nucleus	28	18	8	29.73	5.59	64.32
MsAP2-5	叶绿体Chloroplastic	49	27	4	15.72	8.29	75.99
MsAP2-6	细胞核Nucleus	35	10	6	25.52	5.67	68.81
MsAP2-7	细胞核Nucleus	66	31	7	21.75	10.20	68.05
MsAP2-8	细胞核Nucleus	65	19	8	13.28	3.82	82.90
MsAP2-9	叶绿体Chloroplastic	45	21	9	30.66	11.64	57.70