甘南野生天蓝苜蓿高效共生、抗逆根瘤菌筛选鉴定

doi:10.11686/cyxb2024163

摘要/Abstract

摘要：

为进一步挖掘高寒草地野生天蓝苜蓿根瘤菌资源，筛选与宿主植物高效共生的菌株。本研究利用YMA刚果红培养基从野生天蓝苜蓿中分离根瘤菌，通过菌落形态观察、产酸产碱反应结合16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定，原宿主回接验证其促生特性，离体耐酸、耐碱及温度耐受性测定菌株抗逆能力。结果表明：从野生天蓝苜蓿中分离得到4株菌株，菌落形态和产酸产碱结果符合根瘤菌特性，经鉴定菌株GNT1和GNT6为苜蓿中华根瘤菌，菌株GNT2为吉氏副根瘤菌，菌株GNT4为豆根副根瘤菌。4株根瘤菌回接后植株单株结瘤数、株高、根长及植株干重分别是不接种处理的2.06~3.64倍、0.75~3.17倍、0.21~0.38倍和0.55~2.82倍，有效结瘤数和固氮酶活性分别为11.33~18.00个、5.71~10.97 μmol C₂H₄·g^-1·h^-1，不接种处理下根瘤为无效根瘤且不具有固氮酶活性。4株菌株均能在pH为11时生长，以菌株GNT2生长最佳；不同菌株对NaCl耐受能力不同，其中菌株GNT6耐受5% NaCl，且仅菌株GNT6在4 ℃低温下能够生长，具有在高寒草地应用的潜力。因此，筛选出的苜蓿中华根瘤菌GNT6可作为候选菌株为高寒草地的修复提供优良菌株资源。

关键词: 天蓝苜蓿, 根瘤菌, 抗逆, 高效共生

Abstract:

This research investigated the rhizobacterial resources of wild Medicago lupulina in alpine meadows， by screening for strains exhibiting efficient symbiosis with host plants. YMA Congo red medium was used to isolate rhizobacteria from wild M. lupulina， and strain identification was carried out through colony morphology observation and assessment of acid and alkali production， combined with 16S rRNA gene sequence analysis. Growth-promoting properties were verified by back-inoculation to the original host， and strain resilience was determined by evaluating in vitro acid， alkali and temperature tolerance. Four strains of interest were isolated from wild M. lupulina in this way， designated GNT1， GNT2， GNT4 and GNT6， and the colony morphology and acid and alkali production results were consistent with the characteristics of rhizobia. Strains GNT1 and GNT6 were identified as Sinorhizobium meliloti， GNT2 as Pararhizobium giardinii， and GNT4 as Pararhizobium herbae. Compared with a no-inoculation treatment， rhizobium inoculation increased the number of plant nodules by 2.06-3.64 times， the plant height by 0.75-3.17 times， the root length by 0.21-0.38 times and the plant dry weight by 0.55-2.82 times. The effective nodule number and nitrogenase activity under inoculation treatments were 11.33-18.00 nodules per plant and 5.71-10.97 μmol C₂H₄·g^-1·h^-1， respectively. The nodules under the non-inoculation treatment were ineffective nodules and did not have nitrogenase activity. The four strains could grow at pH 11， and the strain GNT2 grew best. The strains differed in their tolerance to NaCl. Strain GNT6 could tolerate 5% NaCl， and only strain GNT6 could grow at the low temperature of 4 ℃. Hence， strain GNT6 was determined to have potential to be applied in alpine grassland， and is identified in this research as a candidate strain to provide improved rhizobial strain resources for the restoration of alpine grassland.

Key words: Medicago lupulina, rhizobium, strain resilience, efficient symbiosis

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图/表 12

图1 不同菌株菌落形态A：菌株GNT1菌落形态Colony morphology of strain GNT1； B：菌株GNT2菌落形态Colony morphology of strain GNT2； C：菌株GNT4菌落形态Colony morphology of strain GNT4； D：菌株GNT6菌落形态Colony morphology of strain GNT6.

Fig.1 Colony morphology of different strains

表1 菌株菌落形态及产酸产碱能力

Table 1 Colony morphology and acid-alkali production capacity of strains

菌株编号Strain number	菌落形态 Colony morphology	产酸产碱能力 Acid and alkali production
GNT1	灰白色圆形；菌落凸起、质黏，边缘整齐，半透明；生长速度较快。Grayish-white round； colony convex， slimy， neatly edged， translucent； growing fast.	+
GNT2	乳白色圆形；菌落凸起、质黏，边缘整齐，不透明；生长速度快。Milky-white round； colony convex， slimy， neatly edged， opaque； growing faster.	++
GNT4	乳白色圆形；菌落凸起、质黏，边缘整齐，不透明；生长速度快。Milky-white round； colony convex， slimy， neatly edged， opaque； growing faster.	+
GNT6	生长前期灰白色，后期黄色；菌落凸起、质黏，半透明；生长速度快。Pre-growth grayish-white， later yellow； colony convex， sticky， translucent； growing faster.	+++

图2 菌株溴百里香酚蓝检测情况

Fig.2 Bromothymol blue detection of strains

表2 分离菌株分子生物学鉴定

Table 2 Molecular biology identification of isolated strains

菌株 Strains	片段长度 Length （bp）	同源性最高序列的菌株 Strains with the highest homology sequence	相似度 Similarity （%）
GNT1	1359	苜蓿中华根瘤菌S. meliloti LMG-6311 （X67222）	99.41
GNT2	1374	吉氏副根瘤菌P. giardinii H152 （ARBG01000149）	99.85
GNT4	1346	豆根副根瘤菌P. herbae CCBAU 83011 （GU565534）	99.62
GNT6	1377	苜蓿中华根瘤菌S. meliloti LMG-6311 （X67222）	99.48

图3 分离菌株16S rRNA基因序列构建的系统发育树

Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequences of screening strains

图4 菌株处理对天蓝苜蓿单株结瘤数、有效结瘤数及固氮酶活性的影响不同小写字母表示不同菌株处理间差异显著（P<0.05）。Different lowercase letters indicated that there was a significant differences among different strains （P<0.05）. 下同The same below.

Fig.4 Effects of strain treatment on nodule number， effective nodule number and nitrogenase activity of M. lupulina

图5 菌株GNT4回接结瘤（A）、单个根瘤大小（B）情况

Fig.5 Nodulation （A） and single nodule size （B） of strain GNT4

图6 菌株处理对天蓝苜蓿株高、根长及干重的影响

Fig.6 Effects of strain treatment on plant height， root length and dry weight of M. lupulina

表3 菌株NaCl耐受性

Table 3 NaCl tolerance of the strain

菌株编号 Strain number	氯化钠浓度NaCl concentration
菌株编号 Strain number	1%	3%	5%
GNT1	+++	+	+
GNT2	+++	+	-
GNT4	+++	+	-
GNT6	+++	+++	+++

图7 菌株GNT6在5% NaCl条件下的生长状态

Fig.7 Growth status of strain GNT6 under 5% NaCl stress

表4 菌株温度耐受性

Table 4 Temperature tolerance of the strain

菌株编号 Strain number	4 ℃	16 ℃	28 ℃	40 ℃
GNT1	-	+	+++	+++
GNT2	-	+	+++	+
GNT4	-	+	+++	-
GNT6	+	+	+++	+++

图8 不同pH对菌株OD600的影响

Fig.8 The effect of different pH on the strain OD600

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