The use of the tRNA-sgRNA/Cas9 system for gene editing in perennial ryegrass protoplasts

doi:10.11686/cyxb2022180

Abstract

Abstract:

Transfer RNA （tRNA） can link multiple sgRNAs （single-guide RNAs） to form a polycistronic gene， which then combines with a CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated gene 9） expression vector to form a polycistronic tRNA-sgRNA/Cas9 （PTG/Cas9） system for multiple gene editing. The PTG/Cas9 system has been used to alter sgRNAs transcript levels and improve multi-target editing efficiency in rice （Oryza sativa）. To efficiently edit target genes in perennial ryegrass （Lolium perenne）， we generated two CRISPR intermediate vectors with tRNAs to provide a fast and flexible PTG/Cas9 vector construction method. To verify whether the PTG/Cas9 system effectively edits genes in the perennial ryegrass genome， we introduced the PTG/Cas9 plasmid into perennial ryegrass protoplasts by PEG 4000-mediated transformation. Then， we extracted DNA from protoplasts and amplified the target sequences to determine whether they had been edited successfully. The gene editing efficiency was about 6.7%. These results show that the PTG/Cas9 system can be used for gene editing in the ryegrass genome， and provide the basis for further genetic research on， and breeding of perennial ryegrass.

Key words: CRISPR/Cas9, tRNA, multiple gene editing, vector, plasmid, protoplasts, perennial ryegrass

Jia-ming YAO, Huan-huan HAO, Jing ZHANG, Bin XU. The use of the tRNA-sgRNA/Cas9 system for gene editing in perennial ryegrass protoplasts[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2023, 32(4): 129-141.

Figures/Tables 10

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引物Primer	引物序列Primer sequence （5′-3′）
S1F	TTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCT
S1R	ACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGTATGTTATCTTCAGAGGTCTCTTGCACCAGCCGGGAATCGAACC
S2F	CCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCAGCGTGGGTCTCGGTTTTAGAG
S2R	CTGCACATCTGATTCCTCCAAGATCCATGCATGCCTGATAACTTTAAGTTGCTTCAGAAGA
F1	CTCCGTTTTACCTGTGGAATC
R1	TCAACAATATCGTATCAATTTGCACCAGCCGG
F2	AATTGATACGATATTGTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R2	CGGAGGAAAATTCCATCCAC
F3	GGCTCGTATGTTGTGTGG
R3	CGTGTCGGTGTCAGCAAATATGCACCAGCCGG
F4	TATTTGCTGACACCGACACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
F5	TTCAGAGGTCTCTACCGTGGAATCGGCAGCAAA
R5	TTCAGAGGTCTCACGAATTCTCAGGTGCACCAGCCGG
F6	GAGGTCTCGTTCGTATACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R6	AGCGTGGGTCTCGCTCGTCCATCCACTCCAAGC
F7	GCGAGCCTTATAAGCAG
R7	GCTGAGATAACGAGCCAA

引物Primer	引物序列Primer sequence （5′-3′）
S1F	TTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCT
S1R	ACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTAGTATGTTATCTTCAGAGGTCTCTTGCACCAGCCGGGAATCGAACC
S2F	CCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCAGCGTGGGTCTCGGTTTTAGAG
S2R	CTGCACATCTGATTCCTCCAAGATCCATGCATGCCTGATAACTTTAAGTTGCTTCAGAAGA
F1	CTCCGTTTTACCTGTGGAATC
R1	TCAACAATATCGTATCAATTTGCACCAGCCGG
F2	AATTGATACGATATTGTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R2	CGGAGGAAAATTCCATCCAC
F3	GGCTCGTATGTTGTGTGG
R3	CGTGTCGGTGTCAGCAAATATGCACCAGCCGG
F4	TATTTGCTGACACCGACACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
F5	TTCAGAGGTCTCTACCGTGGAATCGGCAGCAAA
R5	TTCAGAGGTCTCACGAATTCTCAGGTGCACCAGCCGG
F6	GAGGTCTCGTTCGTATACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
R6	AGCGTGGGTCTCGCTCGTCCATCCACTCCAAGC
F7	GCGAGCCTTATAAGCAG
R7	GCTGAGATAACGAGCCAA

步骤Steps	反应组分Reaction components	组分名称Component name	体积Volume （μL）
PCR组分 Components of the PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	POT/PT （100 ng·L^-1）	1.0
	上游引物Forward primer	F1/F2/F3/F4 （10 μmol·L^-1）	1.2
	下游引物Reverse primer	R1/R2/R3/R2 （10 μmol·L^-1）	1.2
	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	10.4
	共计Total		30.0
重叠式PCR Overlapping PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	产物1、产物2/产物3、产物4 Product 1， product 2/product 3， product 4	1.0+1.0
	上游引物Forward primer	F5/F6 （10 μmol·L^-1）	1.2
	下游引物Reverse primer	R5/R6 （10 μmol·L^-1）	1.2
	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	9.4
	共计Total		30.0
金门组装反应 Golden gate assembly	缓冲液Buffer	10×CutSmart	1.0
	缓冲液Buffer	10×T4 DNA ligase buffer	1.0
	连接产物Products for connection	产物5 Product 5	2.5
	连接产物Products for connection	产物6 Product 6	2.5
	表达载体Expression vector	pYLCRISPR Cas9Pubi-H	2.0
	限制性内切酶Restriction enzyme	Bsa I	0.5
	连接酶Ligase	T4 DNA ligase	0.5
	共计Total		10.0

步骤Steps	反应组分Reaction components	组分名称Component name	体积Volume （μL）
PCR组分 Components of the PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	POT/PT （100 ng·L^-1）	1.0
	上游引物Forward primer	F1/F2/F3/F4 （10 μmol·L^-1）	1.2
	下游引物Reverse primer	R1/R2/R3/R2 （10 μmol·L^-1）	1.2
	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	10.4
	共计Total		30.0
重叠式PCR Overlapping PCR	PCR缓冲液PCR buffer	2×Phanta Max buffer	15.0
	DRT	dNTP Mix （10 mmol·L^-1）	0.6
	模板Template	产物1、产物2/产物3、产物4 Product 1， product 2/product 3， product 4	1.0+1.0
	上游引物Forward primer	F5/F6 （10 μmol·L^-1）	1.2
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	DNA聚合酶DNA polymerase	Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase	0.6
	双蒸水Double distilled water	ddH₂O	9.4
	共计Total		30.0
金门组装反应 Golden gate assembly	缓冲液Buffer	10×CutSmart	1.0
	缓冲液Buffer	10×T4 DNA ligase buffer	1.0
	连接产物Products for connection	产物5 Product 5	2.5
	连接产物Products for connection	产物6 Product 6	2.5
	表达载体Expression vector	pYLCRISPR Cas9Pubi-H	2.0
	限制性内切酶Restriction enzyme	Bsa I	0.5
	连接酶Ligase	T4 DNA ligase	0.5
	共计Total		10.0

常规PCR Regular PCR			重叠式PCR Overlapping PCR			金门组装Golden gate assembly
步骤Step	温度Temperature （℃）	时间Time （s）	步骤Step	温度Temperature （℃）	时间Time （s）	步骤Step	温度Temperature （℃）	时间Time （s）
1	95	180	1	95	180	1	37	300
2	95	15	2	95	15	2	16	600
3	60	15	3	60	15	3	-	7200
4	72	30	4	72	30
5	-	2100	5	-	2100
6	72	300	6	72	3000