基于全长转录组测序的盐生草SSR标记开发及其遗传多样性分析

doi:10.11686/cyxb2021234

草业学报 ›› 2022, Vol. 31 ›› Issue (8): 199-210.DOI: 10.11686/cyxb2021234

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基于全长转录组测序的盐生草SSR标记开发及其遗传多样性分析

孙禄娟¹^,²(), 何建军¹^,², 汪军成¹^,², 姚立蓉¹^,², 司二静¹^,², 杨轲¹^,², 李葆春¹^,³, 马小乐¹^,², 尚勋武², 孟亚雄¹^,²(), 王化俊¹^,²()

^1.甘肃农业大学省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃兰州 730070
^2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070
^3.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070

收稿日期:2021-06-17 修回日期:2021-10-29 出版日期:2022-08-20 发布日期:2022-07-01
通讯作者: 孟亚雄,王化俊
作者简介:E-mail： whuajun@yahoo.com
E-mail： yxmeng1@163.com
孙禄娟（1995-），女，甘肃武都人，在读硕士。E-mail： 1964341892@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金(32001514);财政部和农业农村部国家大麦青稞产业体系(CARS-05-04B-2);甘肃省教育厅产业支撑计划项目(2021CYZC-12);甘肃省自然科学基金重点项目(20JR10RA507);甘肃省干旱生境作物学国家重点实验室开放基金(GSCS-2019-01);甘肃省高等学校创新能力提升项目(2019A-053);国家973前期研究专项(2014CB160313);甘肃农业大学博士启动经费(GAU-KYQD-2018-02)

Development of SSR markers based on full-length transcriptome sequencing and genetic diversity analysis of Halogeton glomeratus

Lu-juan SUN¹^,²(), Jian-jun HE¹^,², Jun-cheng WANG¹^,², Li-rong YAO¹^,², Er-jing SI¹^,², Ke YANG¹^,², Bao-chun LI¹^,³, Xiao-le MA¹^,², Xun-wu SHANG², Ya-xiong MENG¹^,²(), Hua-jun WANG¹^,²()

^1.State Key Laboratory of Aridland Crop Science，Gansu Agricultural University，Gansu Provincial Key Lab of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，Lanzhou 730070，China
^2.College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China
^3.College of Life Sciences and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China

Received:2021-06-17 Revised:2021-10-29 Online:2022-08-20 Published:2022-07-01
Contact: Ya-xiong MENG,Hua-jun WANG

摘要/Abstract

摘要：

以盐生草全长转录组数据为基础，用MISA在线软件对盐生草转录组水平SSR位点进行搜索，共鉴定到29640个SSR位点，每SSR的发生频率为4.93 kb。SSR种类包含1~6核苷酸重复类型，重复次数主要为4~20次，其中，三核苷酸重复单位最多，占38.25%；四核苷酸重复单位类型最少，仅占3.26%。鉴定到的327种SSR重复类型中，A/T、AG/CT、ATC/GAT、AAG/CTT重复类型出现次数较多。进一步地，对甘肃18个不同生态点盐生草材料进行SSR标记位点的开发及遗传多样性分析。从检测到的29640个SSR标记中选择218对标记进行多态性筛选，共筛选到多态性较高的33对标记，这些标记共检测得到199个等位基因位点，等位基因数（AN）为3~13个，平均为6.03个；基因多样性指数（GD）为0.583~0.869，平均为0.698；基因型数量（GN）为2~13，平均值为5.88；多态性信息含量（PIC）值为0.527~0.856，平均值为0.623。聚类分析结果表明，18个不同生态点盐生草的遗传相似系数（GS）为0.528~0.859，平均值为0.683。在GS为0.68处，可将供试材料划分为四大类。本研究为盐生草种质资源开发及利用提供了参考依据。

关键词: 全长转录组, SSR重复类型, 多态性筛选, 聚类分析

Abstract:

In this study， we used MISA online software to search for SSR loci at the transcriptome level of Halogeton glomeratus based on the full-length transcriptome data of H. glomeratus. A total of 29640 SSR loci were identified. The frequency of each SSR locus was 4.93 kb. SSR types included one- to six-nucleotide repeats， with the number of repeats ranging from four to 20， of which the trinucleotide repeats were the highest， at 38.25% of the total. Tetranucleotide repeats were the least common， comprising only 3.26%. A total of 327 SSR repeat types were identified， the frequencies of A/T， AG/CT， ATC/GAT and AAG/CTT repeat types were much higher than others. Further， SSR markers were developed and the genetic diversity of H. glomeratus from 18 different ecological sites in Gansu was analyzed. From the available 29640 SSR markers， 218 pairs of markers were identified as candidates for polymorphism screening， and 33 pairs of markers with high polymorphism were screened. A total of 199 alleles were detected for these markers， with the number of alleles varying from three to 13 and an average of 6.03. The gene diversity index （GD） ranged from 0.583 to 0.869 with an average of 0.698； the number of genotypes （GN） ranged from two to 13 with an average of 5.88； the polymorphism information content value varied from 0.527 to 0.856 with an average of 0.623. Cluster analysis indicated that the genetic similarity coefficient （GS） of H. glomeratus ranged from 0.528 to 0.859 with an average of 0.683 for 18 different ecological sites in Gansu. At a GS of 0.68， the tested materials were divided into four categories. This study provides reference data for the development and utilization of H. glomeratus germplasm resources.

Key words: full-length transcriptome, SSR repeat types, polymorphism screening, cluster analysis

孙禄娟, 何建军, 汪军成, 姚立蓉, 司二静, 杨轲, 李葆春, 马小乐, 尚勋武, 孟亚雄, 王化俊. 基于全长转录组测序的盐生草SSR标记开发及其遗传多样性分析[J]. 草业学报, 2022, 31(8): 199-210.

Lu-juan SUN, Jian-jun HE, Jun-cheng WANG, Li-rong YAO, Er-jing SI, Ke YANG, Bao-chun LI, Xiao-le MA, Xun-wu SHANG, Ya-xiong MENG, Hua-jun WANG. Development of SSR markers based on full-length transcriptome sequencing and genetic diversity analysis of Halogeton glomeratus[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2022, 31(8): 199-210.

图/表 8

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编号Number	地点Site	编号Number	地点Site	编号Number	地点Site
1	平川区Pingchuan	7	山丹县Shandan	13	永昌县Yongchang
2	酒泉市Jiuquan	8	临泽县Linze	14	兰州新区Lanzhou New Area
3	武威市Wuwei	9	靖远县Jingyuan	15	甘州区Ganzhou
4	肃南县Sunan	10	景泰县Jingtai	16	兰州市Lanzhou
5	金昌市Jinchang	11	民乐县Minle	17	民勤县-收成镇Shoucheng， Minqin
6	会宁县Huining	12	高台县Gaotai	18	民勤县-重兴镇Chongxing， Minqin

编号Number	地点Site	编号Number	地点Site	编号Number	地点Site
1	平川区Pingchuan	7	山丹县Shandan	13	永昌县Yongchang
2	酒泉市Jiuquan	8	临泽县Linze	14	兰州新区Lanzhou New Area
3	武威市Wuwei	9	靖远县Jingyuan	15	甘州区Ganzhou
4	肃南县Sunan	10	景泰县Jingtai	16	兰州市Lanzhou
5	金昌市Jinchang	11	民乐县Minle	17	民勤县-收成镇Shoucheng， Minqin
6	会宁县Huining	12	高台县Gaotai	18	民勤县-重兴镇Chongxing， Minqin

重复次数 Repeat time	单核苷酸 Mono-nucleotide	二核苷酸 Di-nucleotide	三核苷酸 Tri-nucleotide	四核苷酸 Quad-nucleotide	五核苷酸 Penta-nucleotide	六核苷酸 Hexa-nucleotide	合计 Total	比例 Percentage （%）
4	0	0	0	0	795	1004	1799	6.07
5	0	0	5699	579	255	284	6817	23.00
6	0	1917	2754	206	61	64	5002	16.87
7	0	1043	1261	84	21	50	2459	8.30
8	0	566	670	38	12	10	1296	4.37
9	0	367	364	27	12	6	776	2.62
10	0	234	213	10	1	4	462	1.56
11	0	166	113	0	2	2	283	0.95
12	2398	102	73	2	2	1	2578	8.70
13	1576	60	59	2	3	1	1701	5.74
14	1144	38	34	3	3	1	1223	4.13
15	883	46	23	0	0	0	952	3.21
16	666	40	15	3	1	0	725	2.45
17	519	17	16	3	0	0	555	1.87
18	358	9	9	1	0	2	379	1.28
19	290	11	13	2	0	0	316	1.07
20	212	6	5	0	0	0	223	0.75
>20	2017	55	16	5	0	1	2094	7.06

重复次数 Repeat time	单核苷酸 Mono-nucleotide	二核苷酸 Di-nucleotide	三核苷酸 Tri-nucleotide	四核苷酸 Quad-nucleotide	五核苷酸 Penta-nucleotide	六核苷酸 Hexa-nucleotide	合计 Total	比例 Percentage （%）
4	0	0	0	0	795	1004	1799	6.07
5	0	0	5699	579	255	284	6817	23.00
6	0	1917	2754	206	61	64	5002	16.87
7	0	1043	1261	84	21	50	2459	8.30
8	0	566	670	38	12	10	1296	4.37
9	0	367	364	27	12	6	776	2.62
10	0	234	213	10	1	4	462	1.56
11	0	166	113	0	2	2	283	0.95
12	2398	102	73	2	2	1	2578	8.70
13	1576	60	59	2	3	1	1701	5.74
14	1144	38	34	3	3	1	1223	4.13
15	883	46	23	0	0	0	952	3.21
16	666	40	15	3	1	0	725	2.45
17	519	17	16	3	0	0	555	1.87
18	358	9	9	1	0	2	379	1.28
19	290	11	13	2	0	0	316	1.07
20	212	6	5	0	0	0	223	0.75
>20	2017	55	16	5	0	1	2094	7.06

编号 No.	正向引物 Forward primer （5′-3′）	反向引物 Reverse primer （5′-3′）	退火温度Annealing temperature （℃）	重复数 Number of alleles
H2	ACTGGGACAGTTAGATTCGTGAC	AGCGTTGGCAATTAGATATGATG	59	20
H4	CCAACTGTTGACGGAACTGAC	AAAAGCATACCGAGTTGTTTGC	60	18
H12	CAAACATCCAGCAATTCGTCTAC	GATCCGGTACAGATACAGATCCA	60	20
H15	AATTTCATGGTTAAATACCATTGC	AGAGACTTGGTCAACCAACTTAATG	59	14
H17	GTGTTGCAGGCTGACTTAGAGAT	TAGCCAACGGAAGAGATGAATAG	59	12
H34	GATGAAACAGAACAGGGTAATGC	AAGAGAGATGTATCAAGAGCTGAG	58	25
H42	TTGGCACCATAACAATCCTAGAC	ATATTTTGGAGGTAGTTGATGCG	59	35
H87	AGGGAACACACATAACAAACAGC	TTGACTTAGGTCTTAGGGCATGA	60	24
H88	AAGACATAAATTCCGATTCAGGC	GCCATGTATATCATTTTCCGAAC	60	12
H94	GCAGGAATTCATCAGGAAAGTAA	TTGTTTAGTCCTAACATGGCTCG	60	25
H98	CTTGAACGGGAATAATGTAGCAG	TCCTTCCCTGGGATTAGAGATAG	59	21
H107	TCCAGATGCAAATAGTTAGATGGA	TGGTGAAGCTTAAAAAGTGTGTG	59	20
H125	GGCATTCTTCAACAATTACTTCG	AGAATCCAATGAAAGTTAAGGACA	59	16
H131	GCCAAAATGGCAAAGTTGTATAG	CAAAATGGGAAAACGTATAAGGA	59	24
H135	CAACAAGTACGACCACCACC	TGCTTGTTGTAGTTGACGTGG	59	15
H137	TTGATGTGATGTGTTAGGCAATC	TTGGCTTCCTAAGAAGAAATGTG	59	16
H140	CTTGGTCATGAGCTGTTAGTGTG	CCAAATTTTATCAGTTGTCGAGC	59	15
H147	TTCAACTGAAGAATGTGAAGATCC	GTTGCTGAGCGAGTGAGAATAAC	60	21
H148	TTTTTATGGTGTCTTCTTCTATAGTTC	AATGTTTCATGGGAAATTGAGTG	58	20
H153	ATGAGGACTTCACTGATAGCGAG	TAGTCAGTCAGCCAGTCAGTCAG	59	15
H155	ATCAAACAAGTCCACAAGGAGTG	ATTCTTTAAAGGGCAGCTTCAGT	60	15
H157	GAGGGTGTATTTGGATCACTCG	AGTATCCTATACGACTCCTCGGC	60	15
H158	CAGAGAAAGAAGAGCCCAGAGAC	TTCTAATCTCCTTGATTGCCTCA	60	21
H160	GCAGAAGTTGCCAAATCACTTAG	GCAGTTTCACCTACACCAAAATC	60	24
H163	AATGGAGGTTAGAGAGAAGGACG	CCTCTAACATCAACAACTCACCA	59	15
H167	TTGGAAGTAACGATTCATATGGC	CCAATCCAAAATCTCTCAATCAC	60	20
H173	TTACTGCTGCTAATCCACAACAA	GTTGAAGGACCAGAAGTGTTGAC	59	21
H177	GTTGGAAGTCCATTCGTATTCAG	GTTGAGTTGATGTTAAAGGCCAG	59	12
H181	TGTAAGTGGAAGATGAAGCAATATG	CACATGACATATGATACGATGGC	59	25
H187	CACATCACATCACATCATGTAACAC	AAATCCTATAGGTACGGTGAATGG	59	30
H200	CATAGGCAACTAATCACGTTCG	CGAAGTGTAAGAATCTGCATGGT	60	12
H203	CATAGGCAACTAATCACGTTCG	CGAAGTGTAAGAATCTGCATGGT	60	12
H208	GTATTTGCCTTGTTAATCGTTGC	TCCAGCTAGATTAGCCCTTGTAG	59	24

基于全长转录组测序的盐生草SSR标记开发及其遗传多样性分析

Development of SSR markers based on full-length transcriptome sequencing and genetic diversity analysis of Halogeton glomeratus

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参考文献 54

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编号No.	GN	AN	GD	PIC	编号No.	GN	AN	GD	PIC	编号No.	GN	AN	GD	PIC	编号No.	GN	AN	GD	PIC
H2	13	12	0.802	0.786	H94	4	3	0.610	0.527	H148	6	6	0.644	0.644	H177	8	7	0.707	0.706
H4	13	13	0.869	0.856	H98	3	4	0.653	0.588	H153	8	6	0.714	0.713	H181	2	4	0.646	0.645
H12	5	5	0.742	0.698	H107	8	7	0.790	0.759	H155	6	4	0.646	0.645	H187	6	4	0.622	0.621
H15	8	11	0.855	0.838	H125	4	6	0.711	0.711	H157	4	6	0.603	0.603	H200	5	6	0.639	0.639
H17	4	4	0.659	0.592	H131	7	8	0.777	0.776	H158	4	5	0.638	0.637	H203	7	5	0.647	0.647
H34	7	7	0.769	0.735	H135	7	6	0.723	0.723	H160	9	9	0.781	0.780	H208	8	9	0.820	0.819
H42	4	5	0.748	0.705	H137	4	4	0.605	0.604	H163	6	4	0.663	0.662
H87	4	5	0.750	0.710	H140	4	4	0.583	0.583	H167	5	5	0.615	0.614
H88	4	4	0.653	0.591	H147	9	7	0.760	0.759	H173	3	4	0.590	0.589

编号No.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
2	0.859
3	0.764	0.704
4	0.764	0.714	0.709
5	0.643	0.653	0.658	0.668
6	0.663	0.683	0.678	0.719	0.678
7	0.704	0.663	0.668	0.698	0.729	0.759
8	0.729	0.709	0.693	0.683	0.714	0.724	0.834
9	0.709	0.648	0.633	0.693	0.704	0.704	0.784	0.779
10	0.663	0.643	0.608	0.618	0.658	0.668	0.769	0.734	0.784
11	0.709	0.688	0.603	0.633	0.593	0.663	0.643	0.648	0.658	0.764
12	0.724	0.714	0.638	0.668	0.648	0.658	0.729	0.683	0.704	0.658	0.734
13	0.643	0.603	0.648	0.648	0.688	0.709	0.719	0.653	0.683	0.658	0.734	0.759
14	0.648	0.608	0.613	0.643	0.663	0.683	0.754	0.688	0.719	0.724	0.729	0.724	0.794
15	0.653	0.613	0.618	0.618	0.678	0.668	0.698	0.653	0.653	0.739	0.744	0.678	0.769	0.794
16	0.668	0.628	0.583	0.613	0.643	0.633	0.623	0.638	0.658	0.693	0.719	0.663	0.693	0.719	0.744
17	0.678	0.618	0.663	0.643	0.714	0.673	0.714	0.658	0.698	0.714	0.688	0.673	0.734	0.759	0.774	0.789
18	0.598	0.528	0.633	0.623	0.623	0.633	0.653	0.608	0.709	0.623	0.578	0.613	0.704	0.719	0.683	0.678	0.739

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