布顿大麦TB1基因的克隆及内生真菌对其表达量的影响

doi:10.11686/cyxb2022369

草业学报 ›› 2023, Vol. 32 ›› Issue (8): 176-185.DOI: 10.11686/cyxb2022369

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布顿大麦TB1基因的克隆及内生真菌对其表达量的影响

韩丹¹^,³(), 龙凤¹, 陈胜¹, 户萌菲¹, 王栋², 陈水红¹()

^1.塔里木大学生命科学与技术学院，塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300
^2.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300
^3.中国科学院深圳先进技术研究院，广东深圳 518055

收稿日期:2022-09-15 修回日期:2022-10-17 出版日期:2023-08-20 发布日期:2023-06-16
通讯作者: 陈水红
作者简介:E-mail： cshdky@126.com
韩丹（1996-），女，彝族，贵州盘州人，在读硕士。E-mail： 1412694623@qq.com
基金资助:
国家自然科学基金(31802132);塔里木大学校长基金(TDZKZD202201)

Cloning of TB1 from Hordeum bogdanii and the effect of endophytic fungi on its expression

Dan HAN¹^,³(), Feng LONG¹, Sheng CHEN¹, Meng-fei HU¹, Dong WANG², Shui-hong CHEN¹()

^1.School of Life Science and Technology，Tarim University，Key Laboratory of Tarim Basin Biological Resources Conservation and Utilization Corps，Alaer 843300，China
^2.School of Animal Science and Technology，Tarim University，Alaer 843300，China
^3.Shenzhen Institute of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，China

Received:2022-09-15 Revised:2022-10-17 Online:2023-08-20 Published:2023-06-16
Contact: Shui-hong CHEN

摘要/Abstract

摘要：

分蘖生长在茎基部不伸长的节间，有不定根，能独立于主茎存活，禾本科作物布顿大麦主要通过分蘖来提高产量；内生真菌和基因均能调控布顿大麦分蘖，为了探究内生真菌对宿主植物分蘖相关基因TB1的影响，本研究利用RT-PCR法对布顿大麦TB1基因进行克隆并测序，采用生物信息学方法对该基因的序列结果进行分析，用SYBR Green荧光染料法对新疆温宿县和青海柴达木盆地带内生真菌（E+）和不带内生真菌（E-）的布顿大麦TB1基因进行q-PCR相对表达量分析。结果显示，克隆的TB1基因蛋白质编码区（CDS）全长为804 bp，编码267个氨基酸残基；TB1基因无启动子和PolyA位点；经亚细胞定位，TB1蛋白预计在液泡，TB1蛋白无跨膜结构域、无信号肽、不属于跨膜蛋白、存在于TCP家族；推测TB1蛋白为不稳定蛋白质。布顿大麦TB1基因与大麦亚种的TB1同源性最高，为96.72%，且与大麦亚种的TB1处于同一支系。温宿县和柴达木盆地布顿大麦根、茎、叶中TB1基因表达量趋势一致，内生真菌显著降低了植株分蘖发生部位茎基部的TB1基因表达量，表明内生真菌侵染影响了宿主TB1基因表达进而调控宿主植物分蘖。研究结果为后续布顿大麦分蘖机制研究奠定了理论基础。

关键词: 内生真菌, 布顿大麦, TB1基因, 荧光定量PCR

Abstract:

The tillers of the Poaceous crop plant Hordeum bogdanii develop from non-elongating internodes at the base of the stem， form adventitious roots， and can survive independently of the main stem. The yield of H. bogdanii is mainly increased by tillering， which is regulated by both endophytic fungi and genes of the host. To explore the effect of endophytic fungi on the tiller-related gene TB1 in the host plant， the TB1 gene of H. bogdanii was cloned by RT-PCR， sequenced， and then analyzed using bioinformatic methods. The transcript levels of TB1 were determined by PCR using SYBR Green fluorescent dye. These PCR analyses were conducted for H. bogdanii with endophytic fungi （E+） and without endophyte fungi （E-） growing in Wensu County， Xinjiang and Tsaidam Basin， Qinghai. The full-length coding sequence of the TB1 gene clonedfrom H. bogdanii was 804 bp， encoding a polypeptide consisting of 267 amino acid residues. The TB1 gene had no promoter and did not encode a polyA tail. A subcellular localization analysis predicted that TB1 localizes in the vacuole. The TB1 protein， which belongs to the TCP family， has no transmembrane domains and no signal peptide， so it is not a transmembrane protein. It was predicted to be an unstable protein. The TB1 gene of H. bogdanii showed the highest homology （96.72%） with TB1 of Hordeum vulgare subsp.， and was located in the same branch as TB1 from H. vulgare subsp. in the phylogenetic tree. The transcript profiles of TB1 in the roots， stems， and leaves were similar between plants growing in Wensu County and those growing in the Tsaidam Basin. Endophytic fungi significantly reduced the expression of TB1 at the base of stems （the tillering site）. These results show that endophytic fungal infection affects the expression of the host’s TB1 gene， thereby regulating tillering. These findings provide a theoretical foundation for further research on the tillering mechanism of H. bogdanii.

Key words: endophytic fungi, Hordeum bogdanii, TB1, quantitative real-time PCR

韩丹, 龙凤, 陈胜, 户萌菲, 王栋, 陈水红. 布顿大麦TB1基因的克隆及内生真菌对其表达量的影响[J]. 草业学报, 2023, 32(8): 176-185.

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图/表 9

图1 布顿大麦TB1序列

Fig.1 TB1 sequence of H. bogdanii

图 2 回接内生真菌的布顿大麦菌丝镜检箭头所指的蓝色细条表示菌丝体Blue stripes indicated by arrows indicate mycelium.

Fig.2 Microscopic examination of H.bogdanii hyphae with endophytic fungi

图3 tef、tub、act测序结果与接菌前序列比对A： tef；B： tub； C： act； 1：接入前序列The pre-access sequence； 2~4：温宿县Wensu County； 5~7：柴达木盆地Tsaidam Basin.

Fig. 3 tef， tub and act sequencing results and sequence comparison before inoculation

图4 温宿县和柴达木盆地植株分蘖数统计A1：温宿县E+ Wensu County E+ plants； A2：温宿县E-Wensu County E- plants； B1：柴达木盆地Tsaidam Basin E+ plants； B2：柴达木盆地E- Tsaidam Basin E- plants； *表示P<0.05水平下E+、E-间差异显著 * indicates significant differences between E+ and E- at P<0.05 level.

Fig.4 Statistics on the tillers of H.bogdanii plants in Wensu County and Tsaidam Basin

图5 TB1基因PCR扩增电泳M： DL2000 Marker； 1、2： TB1基因条带大小TB1 gene band size.

Fig.5 PCR amplification electrophoresis of TB1 gene

图6 布顿大麦TB1基因系统发育树

Fig.6 Hylogenetic tree of TB1 gene in H.bogdanii

图7 TB1蛋白三级结构预测

Fig.7 Tertiary structure prediction of TB1 protein

表1 两种生态型布顿大麦TB1基因相对表达量

Table 1 Relative expression of TB1 gene in two ecotypes of H. bogdanii

生态型Ecotype	根Root	茎Stem	叶Leaf
温宿县E+ Wensu County E+	0.678±0.056bA	0.328±0.060cA	3.480±0.097aB*
温宿县E- Wensu County E-	1.000±0.003aA*	1.034±0.086aA*	1.006±0.067aA
柴达木盆地E+ Tsaidam Basin E+	0.547±0.067bA	0.382±0.135bA	13.427±0.088aA*
柴达木盆地E- Tsaidam Basin E-	1.008±0.299aA*	1.010±0.164aAA*	1.082±0.222aA

表2 内生真菌在不同部位对温宿县和柴达木盆地布顿大麦TB1基因表达量双因素方差分析

Table 2 Two-way ANOVA of TB1 gene expression of H. bogdanii in Wensu County and Tsaidam Basin by endophytic fungi in different parts

项目 Item	自由度 df	温宿县 Wensu County		柴达木盆地Tsaidam Basin
项目 Item	自由度 df	F	P	F	P
内生真菌Endophytic fungi （E）	1	49.821	0.001	1128.868	0.001
部位Site （S）	2	211.398	0.001	1522.982	0.001
内生真菌×部位E×S	2	215.233	0.001	1488.700	0.001

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布顿大麦TB1基因的克隆及内生真菌对其表达量的影响

Cloning of TB1 from Hordeum bogdanii and the effect of endophytic fungi on its expression

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