白花草木樨MaERF058基因耐旱功能验证

doi:10.11686/cyxb2023338

草业学报 ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (8): 159-169.DOI: 10.11686/cyxb2023338

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白花草木樨MaERF058基因耐旱功能验证

魏娜¹^,³(), 敬文茂¹^,³, 许尔文¹^,³, 王荣新¹^,³, 赵晶忠¹^,³, 马雪娥¹^,³, 张吉宇², 刘文献²()

^1.甘肃省祁连山水源涵养林研究院，甘肃张掖 734000
^2.兰州大学草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室，甘肃兰州 730030
^3.甘肃祁连山森林生态系统国家定位观测研究站，甘肃张掖 734000

收稿日期:2023-09-14 修回日期:2023-11-01 出版日期:2024-08-20 发布日期:2024-05-13
通讯作者: 刘文献
作者简介:E-mail： liuwx@lzu.edu.cn
魏娜（1999-），女，甘肃白银人，硕士。E-mail： 18894026468@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(32061143035);2022年张掖市市级科技计划(ZY2022RC03);兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金(lzujbky-2021-it05)

Functional analysis of the MaERF058 gene in response to drought stress in Melilotus albus

Na WEI¹^,³(), Wen-mao JING¹^,³, Er-wen XU¹^,³, Rong-xin WANG¹^,³, Jing-zhong ZHAO¹^,³, Xue-e MA¹^,³, Ji-yu ZHANG², Wen-xian LIU²()

^1.Academy of Water Resources Conservation Forests in Qilian Mountains of Gansu Province，Zhangye 734000，China
^2.State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems，Lanzhou 730030，China
^3.Gansu Qilian Mountain Forest Eco-System of the State Research Station，Zhangye 734000，China

Received:2023-09-14 Revised:2023-11-01 Online:2024-08-20 Published:2024-05-13
Contact: Wen-xian LIU

摘要/Abstract

摘要：

干旱是农业生产中最常见的逆境胁迫之一，对植物的生长发育、光合作用、气孔开闭、渗透功能和激素调节等方面都会产生不良影响。白花草木樨在我国北方干旱地区广泛种植，是具有耐旱、耐盐碱、耐贫瘠和粗蛋白含量高等特点的优质牧草。转录因子（TF）作为调控基因表达的重要蛋白分子，可作用于其下游启动子区的特定顺式元件以激活或抑制基因的转录，进而调控植物生长发育及响应逆境。植物ERF转录因子家族基因参与植物对非生物胁迫的抗性，是作物抗逆性改良的理想候选基因。本研究对白花草木樨关键耐旱基因MaERF058进行烟草亚细胞定位分析，发现该基因表达蛋白定位于细胞核。干旱胁迫下，过表达MaERF058的拟南芥长势明显优于野生型。干旱条件下转MaERF058基因白花草木樨毛状根脯氨酸含量较对照显著（P<0.01）增加；丙二醛含量显著（P<0.01）降低；过氧化氢酶活性显著（P<0.05）增加；单胺氧化酶染色（NBT法）结果显示转基因毛状根的活性氧含量低于对照。以上结果表明白花草木樨MaERF058基因编码的转录因子对调控白花草木樨响应干旱胁迫具有积极作用。研究结果为解析白花草木樨耐旱分子机制提供了新思路，同时也能够为加快耐旱牧草分子育种提供优异基因资源。

关键词: 白花草木樨, ERF转录因子, 干旱胁迫, 遗传转化

Abstract:

Drought is one of the most common stresses in agricultural production. It has a deleterious effect on plant growth and many aspects of development， such as photosynthetic function， stomatal aperture， osmotic balance， and hormone regulation， thereby affecting crop yield and quality. Melilotusalbus is a high-quality forage legume that is widely grown in the northern arid regions of China because of its high protein content and tolerance to drought， salinity， and barren environments. Transcription factors （TFs） are important proteins that regulate gene expression. They bind to specific cis-elements in the promoter regions of their target genes to activate or repress their transcription， thereby regulating plant growth and development in response to abiotic stress. Genes in the plant ethylene response factor （ERF） TF family respond to various abiotic stresses， and are important components of plant stress resistance mechanisms. MaERF058 is a key drought tolerance gene in M.albus. In this study， we analyzed the subcellular localization of MaERF058 in tobacco （Nicotiana tabacum）， and found that the expressed protein was located in the nucleus. Overexpression of MaERF058 in Arabidopsisthaliana significantly increased its drought tolerance， compared with that of wild type. Compared with the wild type， the MaERF058-overexpressinglines showed significantly increased proline content （P<0.01） and catalase activity （P<0.05） and significantly decreased malondialdehyde content （P<0.01） under drought conditions. Monoamine oxidase staining using the nitroblue tetrazolium method showed that the reactive oxygen content in the roots was higher in the MaERF058-overexpressinglines than in the control. These results suggest that the TF encoded by MaERF058 in M. albus has a positive regulatory role in the drought stress response.

Key words: Melilotusalbus, ERF transcription factor, drought stress, genetic transformation

魏娜, 敬文茂, 许尔文, 王荣新, 赵晶忠, 马雪娥, 张吉宇, 刘文献. 白花草木樨MaERF058基因耐旱功能验证[J]. 草业学报, 2024, 33(8): 159-169.

Na WEI, Wen-mao JING, Er-wen XU, Rong-xin WANG, Jing-zhong ZHAO, Xue-e MA, Ji-yu ZHANG, Wen-xian LIU. Functional analysis of the MaERF058 gene in response to drought stress in Melilotus albus[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2024, 33(8): 159-169.

图/表 8

表1 试验中所用到的PCR引物

Table 1 PCR primers used in the experiment

引物Primer	引物序列Primer sequence （5′-3′）
MsERF058-F	AACCAATGCATTGGATGTACGGAAATAGTAAT
MsERF058-R	GGATCCCGTTAGGAAACCAATAACTGTCC
35S-F	CTATCCTTCGCAAGACCCTTC
MsERF058-R1	GGATCCCGTTAGGAAACCAATAACTGTCC
HPT-F	GGTCGCGGAGGCTATGGATGC
HPT-R	GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT

图 1 MaERF058序列和组织表达模式分析A： MaERF058 基因的结构分析Structural analysis of the MaERF058 gene； B：草木樨ERF蛋白中AP2重复序列The AP2 repeat sequence in the ERF protein of M. albus； C： MaERF058及其他植物同源ERF基因的系统发育树Phylogenetic tree of MaERF058 and other plant homologous ERF genes； D： MaERF058组织表达模式分析The analysis of MaERF058 tissue expression pattern.

Fig. 1 Sequence and tissue expression pattern analysis of MaERF058

图2 MaERF058蛋白烟草表皮亚细胞定位GFP：绿色荧光蛋白Green fluorescent protein； mCherry：细胞核定位标记蛋白Nuclear localization protein； Merge： GFP， mCherry和明场叠加Merged images of GFP， mCherry， and bright field；下同The same below.

Fig. 2 Subcellular localization of MaERF058 protein in tobacco epidermis

图3 MaERF058转基因拟南芥表达量鉴定Col-0：野生型株系Wild-type； OE#1~13：转基因拟南芥不同株系Different strains of transgenic Arabidopsis. 下同The same below.

Fig. 3 Identification of the expression level of MaERF058 transgenic Arabidopsis

图4 干旱胁迫下MaERF058转基因拟南芥平板根长表型评价误差为3个生物学重复的标准误3 biological repeated standard errors； *： P<0.05；下同The same below.

Fig. 4 Evaluation of plate root length phenotype of Arabidopsis transgenic MaERF058 under drought stress

图5 MaERF058瞬时转化毛状根PCR检测及绿色荧光蛋白检测A：毛状根生长表型Hairy root growth phenotype； B：阳性毛状根检测The detection of positive hairy roots； M： Marker； -：空白对照Blank control； +： PHG-MaERF058-EGFP载体质粒Vector plasmid； WT：野生型Col-0； 1~8：不同的阳性毛状根株系Different positive hairy root strains； C：野生型和转基因毛状根绿色荧光蛋白检测The detection of green fluorescent protein in Col-0 and transgenic hairy roots. 下同The same below.

Fig. 5 PCR detection of MaERF058 transient transformation hairy root and green fluorescent protein detection

图6 MaERF058瞬时转化毛状根基因表达量鉴定

Fig.6 Expression identification of MaERF058 transient transformed hairy root

图7 对照和干旱处理下WT和转基因毛状根的生理指标测定*： P<0.05； **： P<0.01.

Fig. 7 Physiological indices of WT and transgenic hairy roots under control and drought treatment

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白花草木樨MaERF058基因耐旱功能验证

Functional analysis of the MaERF058 gene in response to drought stress in Melilotus albus

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