基于转录组学比较研究甜高粱幼苗响应干旱和盐胁迫的生理特征

doi:10.11686/cyxb2020557

摘要/Abstract

摘要：

探究甜高粱响应干旱与盐胁迫的生理学差异及其分子机制，分析甜高粱在干旱和盐胁迫下的不同基因调控机制和代谢通路，可为饲草作物甜高粱抗逆栽培和育种提供依据。以辽甜1号甜高粱幼苗为材料，使用10%的PEG-6000和0.9%的NaCl模拟中度干旱和盐胁迫，胁迫2和7 d时进行光合气体交换参数、内源激素含量、有机渗透调节物质含量和抗氧化物酶活性测定，同时对幼苗叶片进行转录组测序及生物信息学分析，采用 qRT-PCR 方法对测序结果进行验证。结果表明：与对照相比，干旱和盐胁迫均显著影响甜高粱幼苗叶片生理指标的变化，但盐胁迫对甜高粱幼苗叶片光合参数和内源激素生长素、细胞分裂素含量抑制程度均高于干旱胁迫，可溶性糖含量在干旱胁迫下显著高于盐胁迫，抗氧化物酶活性和脱落酸含量低于盐胁迫，说明甜高粱对干旱和盐胁迫响应的生理机制不同；利用转录组测序技术鉴定出甜高粱叶片在处理2 d时，干旱和盐胁迫下分别有922和2047个上调基因以及975和1714个下调基因，处理7 d时分别鉴定到157和795个上调基因以及54和722个下调基因；同时鉴定出40个干旱胁迫响应基因和493个盐胁迫响应基因，基于GO富集分析发现甜高粱幼苗在干旱和盐胁迫下响应基因均显著富集于植物逆境响应相关通路，KEGG富集分析发现，干旱胁迫响应基因显著富集于内质网加工和剪切体代谢通路，盐胁迫响应基因显著富集在植物激素信号转导代谢通路；对光合作用、植物激素信号转导、抗氧化物酶和淀粉与蔗糖代谢通路相关差异基因进行分析发现，这些差异基因的表达模式与生理指标变化趋势吻合。因此，甜高粱在转录水平上对盐胁迫的适应稳态落后于干旱胁迫，中度胁迫下甜高粱幼苗对盐胁迫的耐受性要低于干旱胁迫，可溶性糖在甜高粱幼苗抵御干旱胁迫中发挥重要作用，植物激素信号转导和抗氧化物酶活性变化的共同调控是甜高粱幼苗对抗盐胁迫的关键。

关键词: 甜高粱幼苗, 干旱胁迫, 盐胁迫, 生理, 转录组分析

Abstract:

This research aimed to explore the molecular mechanisms， metabolic pathways and physiological differences of responses to drought and salt stress in sweet sorghum， in order to strengthen the scientific information available to enhance sweet sorghum forage crop husbandry and breeding. Seedlings of sweet sorghum cultivar Liaotian No.1 were used to provide the plant material for study. Moderate drought stress was induced using 10% PEG-6000 solution and salt stress was simulated using 0.9% NaCl solution. Photosynthetic gas exchange parameters， endogenous hormone content， content of organic osmotic regulatory substances and antioxidant enzyme activities were determined on days 2 and 7 of stress exposure. Concurrently， transcriptome sequencing and bioinformatics analyses were carried out on seedling leaves， and qRT-PCR was used to verify the sequencing results. For sweet sorghum seedlings under salt stress， photosynthetic parameters， endogenous auxin concentration and degree of cytokinin inhibition were higher than under drought stress； Soluble sugar content was significantly higher under drought stress than under salt stress； Antioxidant enzyme activities and abscisic acid concentrations were higher under salt stress than under drought stress， indicating different physiological mechanisms of drought and salt stress response in sweet sorghum. Under drought stress on day 2， transcriptome sequencing identified 922 up-regulated and 975 down-regulated genes while under salt stress there were 2047 up-regulated and 1714 down-regulated genes. At day 7 under drought stress there were 157 up-regulated and 54 down-regulated genes while under salt stress there were 795 up-regulated and 722 down-regulated genes. Forty drought stress response genes and 493 salt stress response genes were also identified. Gene ontology （GO）-based enrichment analysis revealed that sweet sorghum seedlings under drought and salt stress were significantly enriched in pathways involving plant response to stress. Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） enrichment analysis showed that genes up-regulated in response to drought stress tended to be involved in endoplasmic reticulum processing and shear body metabolism pathways， while salt stress response genes were generally associated with plant hormone signal transduction metabolic pathways. Analysis of the genes related to photosynthesis， plant hormone signal transduction， antioxidant enzymes and starch and sucrose metabolic pathways showed that the expression patterns of these genes were consistent with the observed changes in physiological indicators. Therefore， sweet sorghum adaptation to salt stress lags behind response drought stress at the transcriptional level. Meanwhile， the tolerance of sweet sorghum seedlings to moderate salt stress was lower than that under moderate drought stress. Soluble sugars played an important role in the resistance to drought stress of sweet sorghum seedlings. The joint regulation of plant hormone signal transduction and antioxidant enzyme activity changes was the key to the resistance of sweet sorghum seedlings to salt stress.

Key words: sweet sorghum seedlings, drought stress, salt stress, physiology, transcriptomic analysis

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图/表 11

表1 差异基因引物序列

Table 1 Differential gene primer sequences

基因ID Gene ID	正向引物 Forward primer （5′-3′）	反向引物 Reverse primer （5′-3′）
gene11095	CAAGGAGATCCTCAAGATCG	AACTTGAGGGGCTTCACCAC
gene13164	ACAAGCTGACTGGCGTCACT	GAGGAACTCGTGTGTCCCAG
gene13763	GACATCACGGGCCTCTACAT	ATGACGTACTTGGCCTCGAT
gene17162	ATGTGGCTCATCGACGAACT	TACGACAGGCCTTCCTGCT
gene17374	AATAGACCCAACTCCTGAAC	CTTCATCAAGGCTTCCACTG
gene25496	TCGTCATCGAGGCCTACAAG	AGGAGGGAGTTGGTGGACTT
gene25654	ACTCTACGAGAAGCACGAGG	TTCTTCTTCTCGTGGTGCTC
gene31707	GCTCATCTGCCAGGAGTACG	GTTGAGCGACTTGTAGACGG
gene4250	ACGTCGAGGACAATGAGACC	AGCTCGAGTACATGCAGTAG
gene8166	GTGGGTTATTCTTGGACACT	CTCCTATGCAGGCAATAAGC

图1 干旱和盐胁迫下甜高粱幼苗叶片光合气体交换参数的变化同一时间的不同字母表示差异显著（P<0.05），下同。Different letters at the same time indicate significant differences （P<0.05），the same below.

Fig.1 Changes in leaf photosynthetic parameters of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

图2 干旱和盐胁迫下甜高粱幼苗叶片内源激素含量的变化

Fig.2 Changes in leaf endogenous hormone content of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

图3 干旱和盐胁迫下甜高粱幼苗叶片主要有机渗透调节物质含量的变化

Fig.3 Changes in leaf osmotic adjustment substance content in sweet sorghum seedling under drought and salt stress

图4 干旱和盐胁迫下甜高粱幼苗叶片抗氧化物酶活性的变化

Fig.4 Changes in leaf antioxidant enzyme activity of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

表2 样品测序和数据比对统计

Table 2 Sample sequencing and data comparison statistics

样品名称 Sample ID	过滤后数据 Clean reads	错误率 Error rate （%）	Q₂₀值 Q₂₀ （%）	Q₃₀值 Q₃₀ （%）	GC含量 GC content （%）	定位到参考基因组上的clean reads数 The number of clean reads mapped to the reference genome
CK2_1	57425630	0.0228	98.89	96.45	56.48	55361409（96.41%）
CK2_2	60983370	0.0226	98.97	96.66	56.99	58918196（96.61%）
CK2_3	51111204	0.0226	98.98	96.66	56.47	49100413（96.07%）
CK7_1	56728540	0.0241	98.35	95.14	57.72	54902246（96.78%）
CK7_2	53934386	0.0242	98.31	95.06	57.05	52136670（96.67%）
CK7_3	51439608	0.0239	98.45	95.34	55.14	49452077（96.14%）
D2_1	52216072	0.0226	98.97	96.65	54.97	50289972（96.31%）
D2_2	57679448	0.0227	98.95	96.55	55.20	55522573（96.26%）
D2_3	57022218	0.0227	98.95	96.59	55.94	54992698（96.44%）
D7_1	57220412	0.0240	98.38	95.20	56.24	55260378（96.57%）
D7_2	52471316	0.0242	98.29	94.98	56.94	50624415（96.48%）
D7_3	48330116	0.0239	98.42	95.28	56.13	46730432（96.69%）
S2_1	55413052	0.0226	98.97	96.70	56.01	53508304（96.56%）
S2_2	53001756	0.0227	98.96	96.61	55.75	51205821（96.61%）
S2_3	50589156	0.0226	98.98	96.67	55.49	48505209（95.88%）
S7_1	51841776	0.0241	98.33	95.05	56.38	50074578（96.59%）
S7_2	52991606	0.0238	98.47	95.44	56.75	51135623（96.50%）
S7_3	55635952	0.0239	98.41	95.27	55.05	53377926（95.94%）

图5 差异表达基因统计和韦恩图CK、干旱胁迫、盐胁迫在2和7 d时的样本分别命名CK2、CK7、D2、D7、S2、S7。The samples of CK， drought stress， and salt stress at 2 and 7 days were named CK2， CK7， D2， D7， S2， S7， respectively. DEG：差异表达基因Differential expression gene.

Fig.5 DEG statistics graph and Venn diagram

图6 干旱和盐胁迫响应差异基因GO富集分析

Fig.6 GO enrichment analysis of DEG in response to drought and salt stress

图7 干旱和盐胁迫响应差异基因KEGG富集分析纵轴表示通路名称，横轴表示富集因子，点的大小表示此通路中基因个数，而点的颜色对应于不同的P-adjust范围。The vertical axis indicates the pathway name， the horizontal axis indicates the rich factor， the size of the dots indicates the number of genes in the pathway， and the color of the dots corresponds to the different P-adjust ranges.

Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEG in response to drought and salt stress

图8 干旱和盐胁迫下的相关差异基因表达水平值热图

Fig.8 Heat map of elated DEGs expression levels under drought and salt stress

图9 实时荧光定量PCR验证RNA-seq数据

Fig.9 Real-time fluorescence quantitative PCR validation RNA-seq data

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