藜麦NAC转录因子CqNAC66响应干旱和盐胁迫的功能研究

doi:10.11686/cyxb2025088

摘要/Abstract

摘要：

为探究藜麦NAC家族成员CqNAC66基因的抗旱耐盐功能，本研究对CqNAC66进行亚细胞定位，并将CqNAC66基因导入本氏烟草中进行过表达，比较野生型和转基因株系在干旱（20%PEG-6000）和盐（200 mmol·L^-1 NaCl）胁迫下的形态及生理响应。结果表明，CqNAC66转录因子定位在细胞核中；过表达CqNAC66能够显著降低烟草植株的离体叶片失水率；在干旱和盐胁迫下，过表达CqNAC66能够显著降低烟草的萎蔫指数，并显著提高烟草叶片的表面积和地上部鲜重；过表达CqNAC66能够显著提高烟草叶片的叶绿素相对含量（SPAD值）和过氧化物酶活性，显著降低丙二醛含量。综上所述，CqNAC66在烟草中的异源表达能够显著提高烟草植株的抗旱性和耐盐性，CqNAC66可能通过保持植株的叶绿素稳定，调节植物的抗氧化酶系统，缓解胁迫造成的细胞氧化损伤来提高转基因烟草抵抗干旱和盐胁迫的能力。

关键词: 藜麦, CqNAC66, 抗旱, 耐盐, 功能验证

Abstract:

This research explored the function of quinoa （Chenopodium quinoa） NAC family member， CqNAC66 involved in drought resistance and salt tolerance. CqNAC66 was subcellularly localized in this study， and transgenic lines of Nicotiana benthamiana overexpressing CqNAC66 were obtained to compare the morphological and physiological responses of wild-type （WT） and transgenic plants after exposure to drought （20% PEG-6000） and salt （200 mmol·L^-1 NaCl） stress. The results showed that CqNAC66 protein was subcellularly localized in the nucleus. Overexpression of CqNAC66 significantly decreased the water loss rates of excised leaves of tobacco plants. Under drought and salt stress treatment， overexpression of CqNAC66 in tobacco plants significantly decreased the leaf wilting index， and significantly increased the leaf surface area and aboveground fresh weight. In addition， overexpression of CqNAC66 significantly increased the relative content of chlorophyll （SPAD） and the activities of peroxidase， and significantly decreased the content of malondialdehyde in leaves of the studied tobacco plants. In conclusion， the heterologous expression of CqNAC66 in N. benthamiana improved the drought and salt tolerance of plants and CqNAC66 appeared to improve the resistance of transgenic tobacco by maintaining the stability of chlorophyll， regulating the plant antioxidant enzyme system and alleviating the cellular oxidative damage caused by stress.

Key words: quinoa, CqNAC66, drought resistance, salt tolerance, functional verification

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图/表 9

表1 本研究所使用的引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study

名称Name	序列Sequences （5′-3′）	用途 Purposes
CqNAC66-F₁	TCGCAAGACCCTTCCTCTAT	CqNAC66转基因烟草PCR鉴定PCR identification of CqNAC66 transgenic tobacco plants
CqNAC66-R₁	CGTGACCCGTTTGGGTATTT
β-actin-F	CTCCGTCTTGACTTGGCAGG	CqNAC66转基因烟草qPCR鉴定 qPCR identification of CqNAC66 transgenic tobacco plants
β-actin-R	ACAATTTCCCGCTCAGCTGA
CqNAC66-F₂	GAGTGCGGCAAAGCCTACAA
CqNAC66-R₂	ACCCGGTAAAGGCGAATTCA
CqNAC66-EGFP-F	CATTTGGAGAGGACACGCATGGGAGTTCAAGAGAAAGATCC	克隆CqNAC66 Cloning of CqNAC66
CqNAC66-EGFP-R	TCGCCCTTGCTCACCATGAACTGTCTGTATCCGTATCCGAAT	克隆CqNAC66 Cloning of CqNAC66

图1 烟草植株的萎蔫程度分级A： 0级，植株无任何萎蔫症状Grade 0， no wilting symptoms on the plant； B： 1级，植株叶片出现轻微萎蔫Grade 1， slight wilting symptoms on the plant’s leaves； C： 2级，植株叶片萎蔫明显，叶柄轻微变软Grade 2， obvious wilting symptoms on the plant’s leaves and slight softening of the petioles； D： 3级，植株叶片萎蔫较严重，叶柄明显变软Grade 3， severe wilting on the plant’s leaves and obvious softening of the petioles； E： 4级，植株叶片萎蔫严重，叶柄严重变软Grade 4， extremely severe wilting on the plant’s leaves and severe softening of the petioles.

Fig. 1 Grading of wilting degree of tobacco plants

图2 重组质粒pCAM-CqNAC66-EGFP的构建和农杆菌GV3101的转化A： CqNAC66的PCR扩增电泳图The electrophoretic gel images of PCR amplification of CqNAC66； M： DL2000； 1：扩增样本Amplification sample； B： pCAM-CqNAC66-EGFP重组载体的图谱The map of pCAM-CqNAC66-EGFP recombinant vector； C：转CqNAC66农杆菌菌落PCR的扩增电泳图The electrophoretic gel images of PCR amplification of CqNAC66 in A. tumefaciens； 1~6：扩增样本Amplification samples； CK：空白对照（ddH2O）Blank control （ddH2O）； P：阳性对照Positive control.

Fig.2 Vector construction of pCAM-CqNAC66-EGFP and transformation of A. tumefaciens GV3101

图3 CqNAC66的亚细胞定位CqNAC66-GFP融合蛋白和GFP蛋白在本氏烟草中进行瞬时表达，转化后的叶片用共聚焦显微镜进行观察。第1列的细胞是在GFP荧光信号下进行观察；第2列为相同细胞在叶绿体荧光通道下进行观察；第3列为明场下进行观察；第4列为上述3列的融合叠加图像。Bar=20 μm。The CqNAC66-GFP fusion and free GFP （green fluorescent protein） were transiently expressed in transgenic N. benthamiana plants， and the transformed leaves were observed by confocal microscopy. Images in the first column show cells with GFP signal. Images in the second column show the same cells under chloroplast fluorescence channels （CHI）. Images in the third column show the bright field view of the same cells， and the images in the fourth column are the overlays of the bright-field and fluorescent images.

Fig.3 Subcellular localization of CqNAC66

图4 CqNAC66过表达载体的构建及烟草的基因转化Ⅰ： CqNAC66序列 CqNAC66 sequence； Ⅱ：测序结果 Sequencing result； Ⅲ：一致 Consensus. A： CqNAC66的CDS序列The CDS sequence of CqNAC66； B： pCAM-CqNAC66重组载体的图谱The map of pCAM-CqNAC66 recombinant vector； C~E： CqNAC66在烟草中的遗传转化，其中C为共培养基上的烟草叶片， D为芽的诱导分化，E为生根培养The transformation of CqNAC66 in tobacco， C was tobacco leaves on co-culture medium， D was the induction of bud differentiation， and E was the rooting culture.

Fig.4 Vector construction for CqNAC66 overexpression and CqNAC66 transformation of tobacco

图5 CqNAC66转基因烟草的分子鉴定A： CqNAC66转基因烟草的PCR鉴定The PCR identification of CqNAC66 transgenic tobacco； M： DL2000； 1~20： T0代株系T0 generation lines； WT：阴性对照（野生型）Negative control （wild type）； CK：空白对照（ddH2O） Blank control （ddH2O）； P：阳性对照（CqNAC66转基因农杆菌菌液）Positive control （CqNAC66 transgenic A. tumefaciens）； B：转基因烟草的CqNAC66表达量检测Detection of CqNAC66 expression levels in transgenic tobacco；不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著，下同Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05level， the same below.

Fig.5 The molecular identification of CqNAC66 transgenic tobacco plants

图6 干旱和盐胁迫处理下野生型和CqNAC66转基因烟草株系的表型

Fig.6 Phenotypes of wild type （WT） and CqNAC66 transgenic tobacco lines under drought and salt stress treatment

图7 干旱和盐胁迫处理下野生型和CqNAC66转基因烟草株系形态指标的变化每个处理统计自9株独立的烟草植株Each treatment was statistically analyzed from 9 independent tobacco plants； **： P<0.01.

Fig.7 Changes of morphological indices of wild type （WT） and CqNAC66 transgenic tobacco lines under drought and salt stress treatment

图8 干旱和盐胁迫处理下野生型和CqNAC66转基因烟草株系的生理指标的变化

Fig.8 Changes of physiological indices of wild type （WT） and CqNAC66 transgenic tobacco lines under drought and salt stress treatment

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