草地早熟禾种带可培养细菌多样性及18个菌株促生特性研究

doi:10.11686/cyxb2024086

草业学报 ›› 2024, Vol. 33 ›› Issue (12): 134-146.DOI: 10.11686/cyxb2024086

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草地早熟禾种带可培养细菌多样性及18个菌株促生特性研究

谢金晶¹(), 朱绍玮¹, 黄荣¹, 杨杰¹, 侯瑄¹, 张振粉¹^,²()

^1.甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州 730070
^2.草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070

收稿日期:2024-03-19 修回日期:2024-04-22 出版日期:2024-12-20 发布日期:2024-10-09
通讯作者: 张振粉
作者简介:. E-mail： zhangzf@gsau.edu.cn
谢金晶（1998-），女，甘肃平凉人，在读硕士。E-mail： xiejj@st.gsau.edu.cn
基金资助:
国家自然科学基金(32060369);甘肃省杰出青年基金(20JR10RA562);草业生态系统教育部重点实验室-人才培育项目(KLGE202203)

A study of the diversity of cultivable seed-borne bacteria in Poa pratensis and the growth-promoting characteristics of 18 bacterial strains

Jin-jing XIE¹(), Shao-wei ZHU¹, Rong HUANG¹, Jie YANG¹, Xuan HOU¹, Zhen-fen ZHANG¹^,²()

^1.College of Pratacultural Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China
^2.Key Laboratory of Grassland Ecosystem，Ministry of Education，Engineering Laboratory of Gansu Province，Sino-U. S. Center for Grassland Ecosystem Sustainability，Lanzhou 730070，China

Received:2024-03-19 Revised:2024-04-22 Online:2024-12-20 Published:2024-10-09
Contact: Zhen-fen ZHANG

摘要/Abstract

摘要：

为探究草地早熟禾种带可培养细菌的多样性并筛选其中促生功能优异的菌株，本研究采用稀释涂布平板法对3个品种草地早熟禾种带可培养细菌进行分离，得到30个细菌分离物。通过16S rRNA序列分析，对18株形态特征具有差异的代表性分离物进行鉴定并构建系统发育树。结果表明，分离并鉴定的种带可培养细菌有厚壁菌门、放线菌门和变形菌门，分属于6个属，分别为芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、短小杆菌属、寡养单胞菌属和欧文氏菌属，其中芽孢杆菌属为3个品种的共有属。对18株细菌的固氮、产吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）、溶磷、产胞外酶（蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶）能力测定发现，菌株BM8和KTJ14同时具有上述功能中的3种。此外，采用结晶紫染色法和泳动培养基对菌株的生物被膜形成能力及泳动能力这2种促生相关的生物学特性进行测定，并讨论了生物被膜形成能力和泳动性与菌株促生功能之间的相关性，其中，KTJ16是生物被膜形成能力最强的菌株，SW5和KTJ18的泳动能力显著强于其他菌株。综合几种特性，最终筛选出具有优异促生特性的菌株为BM8、SW5、KTJ14、KTJ16和KTJ18。

关键词: 固氮, 溶磷, 产IAA, 产胞外酶, 生物被膜, 泳动能力

Abstract:

This study investigated the diversity of cultivable seed-borne bacteria of Poa pratensis to identify strains with superior plant growth-promoting properties. The cultivable seed-borne bacteria of three varieties of P. pratensis were isolated by the dilution plate method and 30 bacterial isolates were obtained. Through 16S rRNA sequence analysis， 18 representative isolates with different morphological characteristics were identified and phylogenetic trees were constructed. It was found that the isolated cultivable seed-borne bacteria so identified belonged to the phyla Firmicutes， Actinobacteria and Proteobacteria， and included six genera， Bacillus， Paenibacillus， Pseudomonas， Curtobacterium， Stenotrophomonas and Erwinia. Among them， Bacillus is the common genus of three varieties. The nitrogen fixation， indole-3-acetic acid-producing， phosphorus solubilization and extracellular enzyme （protease， cellulase and amylase） production of the 18 bacterial taxa were determined and it was found that strains designated BM8 and KTJ14 possessed all three of the above functions. In addition， the biofilm formation ability and swimming motility of the strains were determined by crystal violet staining and swimming medium， and the correlation between these two traits and the growth-promoting function of isolated taxa is discussed. A strain designated KTJ16 had the strongest biofilm formation ability， and the swimming motility of taxa designated SW5 and KTJ18 was significantly stronger than that of other taxa. Based on multiple characteristics， the strains with superior growth-promoting characteristics were determined to be BM8， SW5， KTJ14， KTJ16 and KTJ18.

Key words: nitrogen fixation, phosphorus solubilizing, IAA-producing, producing extracellular enzymes, biofilm, swimming motility

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图/表 7

图1 草地早熟禾种带可培养细菌分离物形态特征图中均为10-2稀释梯度下的细菌分离平板。The bacterial separation plates at a 10-2 dilution gradient were all shown in the diagram.

Fig.1 Morphological characteristics of cultivable bacterium isolates in seeds of P. pratensis

图2 草地早熟禾种带可培养细菌的16S rRNA系统进化树

Fig.2 16S rRNA phylogenetic tree of cultivable seed-borne bacteria in P. pratensis

表1 草地早熟禾种带可培养细菌在种子中的数量、属水平分类和登录号

Table 1 Number， genus level classification and accession number of cultivable seed-borne bacteria in P. pratensis

菌株 Strain	数量Number （CFU·g^-1）	属水平分类 Genus level classification	登录号 Accession
BM2	1.95×10⁵a	短小杆菌属Curtobacterium sp.	PP094560
BM4	2.33×10⁴def	假单胞菌属Pseudomonas sp.	PP094561
BM8	3.33×10³f	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094562
BM9	5.33×10³ef	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094563
BM10	2.47×10⁴de	短小杆菌属Curtobacterium sp.	PP094564
BM12	1.46×10⁵b	假单胞菌属Pseudomonas sp.	PP094565
KTJ3	2.27×10⁴def	类芽孢杆菌属Paenibacillus sp.	PP094566
KTJ5	7.67×10⁴c	欧文氏菌属Erwinia sp.	PP094567
KTJ9	1.07×10⁴def	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094568
KTJ14	2.13×10⁴def	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094569
KTJ16	8.67×10³def	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094570
KTJ18	2.67×10³f	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094571
SW1	3.47×10⁴d	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094572
SW3	6.67×10³ef	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094574
SW5	4.67×10³ef	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094575
SW9	3.33×10³f	芽孢杆菌属Bacillus sp.	PP094576
SW10	1.33×10⁴def	寡养单胞菌属Stenotrophomonas sp.	PP094573
SW11	5.93×10⁴c	类芽孢杆菌属Paenibacillus sp.	PP094577

图3 草地早熟禾种带可培养细菌属水平Venn图

Fig.3 Venn diagram of cultivable seed-borne bacteria in P. pratensis at genus level

表2 草地早熟禾种带可培养细菌的固氮、产吲哚-3-乙酸、溶磷和产胞外酶能力

Table 2 The ability of nitrogen fixation （NF）， indole-3-acetic acid-producing（IAAP）， phosphate solubilizing and extracellular enzyme producing of cultivable seed-borne bacteria in P. pratensis

菌株 Strain	固氮 NF	产吲哚-3-乙酸 IAAP （μg·mL^-1）	溶磷 Phosphorus solubilizing （D/d ）		产胞外酶 Producing extracellular enzymes （D/d ）
菌株 Strain	固氮 NF	产吲哚-3-乙酸 IAAP （μg·mL^-1）	有机磷 Organic phosphorus	无机磷 Inorganic phosphorus	蛋白酶 Protease	纤维素酶 Cellulase	淀粉酶 Amylase
BM2	＋	－	－	－	2.34±0.09c	－	－
BM4	＋	－	－	1.20±0.024a	－	－	－
BM8	＋	19.21±0.16a	－	－	1.80±0.02de	－	－
BM9	＋	－	－	－	2.41±0.09bc	3.05±0.10cd	2.42±0.05c
BM10	＋	－	－	－	2.63±0.02ab	3.78±0.11b	－
BM12	＋	－	－	1.15±0.023a	－	－	－
KTJ3	＋	－	－	－	－	3.38±0.07c	2.93±0.07b
KTJ5	＋	－	－	－	－	－	－
KTJ9	＋	－	－	－	2.04±0.02d	2.58±0.06e	1.51±0.02d
KTJ14	＋	18.42±0.12b	－	－	1.73±0.04ef	－	－
KTJ16	－	18.46±0.23b	－	－	1.30±0.02g	－	－
KTJ18	＋	－	－	－	1.79±0.05de	3.07±0.03cd	－
SW1	－	－	－	－	1.50±0.02fg	－	1.37±0.02d
SW3	－	－	－	－	1.29±0.01g	2.87±0.10de	2.27±0.04c
SW5	＋	－	－	－	2.30±0.08c	2.96±0.07de	－
SW9	＋	－	－	－	1.87±0.02de	－	－
SW10	－	－	－	－	2.75±0.13a	－	－
SW11	＋	－	－	－	－	4.62±0.12a	3.34±0.08a

图4 草地早熟禾种带可培养细菌的产吲哚-3-乙酸、溶磷和产胞外酶能力试验A：种带可培养细菌的吲哚-3-乙酸显色反应Indole-3-acetic acid color reaction of cultivable seed-borne bacteria； B：种带可培养细菌在蒙金娜无机磷培养基上的生长情况Growth of culturable bacteria in Mongjna medium inorganic phosphorus medium； C， D， E：分别为种带可培养细菌在含淀粉、羧甲基纤维素钠和脱脂牛奶的功能培养基上的生长情况The growth of cultivable seed-borne bacteria on the functional medium containing starch， sodium carboxymethyl cellulose and skim milk， respectively.

Fig.4 Experiments on the indole-3-acetic acid-producing， phosphate solubilizing and extracellular enzyme producing of cultivable seed-borne bacteria in P. pratensis

图5 草地早熟禾品种可培养种带细菌在微孔板上的生物被膜产生能力（A）及其在泳动培养基上形成的浑浊区域直径（B）A图中，CK作为阴性对照。ODc和生物被膜形成能力用横线标出， 0：无生物被膜形成能力菌； 1：弱生物被膜形成能力菌； 2：中等生物被膜形成能力菌； 3：强生物被膜形成能力菌。B图中，不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。In Fig.A， CK as a negative control. ODc and biofilm formation ability were marked with a horizontal line， 0： Biofilm nonproducers； 1： Weak biofilm producers； 2： Medium biofilm producers； 3： Strong biofilm producers. In Fig. B， different letters denote significant difference （P<0.05）.

Fig.5 The biofilm formation ability on microtiter plate of cultivable seed-borne bacteria in P. pratensis （A） and the diameter of turbid area formed on swimming medium （B）

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草地早熟禾种带可培养细菌多样性及18个菌株促生特性研究

A study of the diversity of cultivable seed-borne bacteria in Poa pratensis and the growth-promoting characteristics of 18 bacterial strains

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图/表 7

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