蒺藜苜蓿MtBMI1基因克隆及抗旱性分析

doi:10.11686/cyxb2024303

草业学报 ›› 2025, Vol. 34 ›› Issue (6): 139-153.DOI: 10.11686/cyxb2024303

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蒺藜苜蓿MtBMI1基因克隆及抗旱性分析

赵媛媛¹^,²(), 蒲小剑¹^,², 徐成体¹^,², 王伟¹^,², 傅云洁¹^,²

^1.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016
^2.农业农村部西北耕地保育及边际土地改良企业重点实验室，青海德令哈 817000

收稿日期:2024-07-31 修回日期:2024-09-20 出版日期:2025-06-20 发布日期:2025-04-03
通讯作者: 赵媛媛
作者简介:赵媛媛（1991-），女，山东威海人，助理研究员，博士。E-mail： 18893147262@163.com
赵媛媛（1991-），女，山东威海人，助理研究员，博士。E-mail： 18893147262@163.com
基金资助:
省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室自主课题(2024-ZZ-16);青海省重大科技专项(2023-NK-A3);青海大学青年科研基金(2023-QNY-6)

Cloning of the MtBMI1 gene from Medicago truncatula and its role in drought tolerance

Yuan-yuan ZHAO¹^,²(), Xiao-jian PU¹^,², Cheng-ti XU¹^,², Wei WANG¹^,², Yun-jie FU¹^,²

^1.Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining 810016，China
^2.Northwest Key Laboratory of Cultivated Land Conservation and Marginal Land Improvement，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Delingha 817000，China

Received:2024-07-31 Revised:2024-09-20 Online:2025-06-20 Published:2025-04-03
Contact: Yuan-yuan ZHAO

摘要/Abstract

摘要：

干旱不利于植物的正常生长、发育及繁殖，是造成农作物及饲草产量降低的重要因素之一。BMI1蛋白作为PcG蛋白复合体中唯一介导组蛋白泛素化的成员，在参与植物对外界非生物胁迫响应的表观遗传调控中发挥重要的作用。以蒺藜苜蓿为材料，克隆得到PcG家族成员MtBMI1，该基因全长5386 bp，编码429个氨基酸，具有zf-C3HC4和RAWUL两个保守的功能结构域。系统进化树分析表明该基因与菜豆PvBMI1-1和大豆GmBMI1-1亲缘关系更接近。烟草表皮亚细胞定位结果表明该基因编码的蛋白定位在细胞核上。GUS化学染色结果表明在成熟的拟南芥花序及柱头、花茎和果柄中具有较强的MtBMI1启动子表达活性。将MtBMI1在拟南芥中过表达进行功能分析，结果表明转基因拟南芥H2AK119ub组蛋白含量相比野生型显著（P<0.05）升高，同时干旱处理后的转基因株系相比野生型产生明显的失水表型，且根长、根鲜重和地上鲜重显著（P<0.05）低于野生型，丙二醛含量显著（P<0.05）高于野生型。以上结果表明MtBMI1在蒺藜苜蓿干旱胁迫响应中发挥负调控作用，该研究可为进一步揭示蒺藜苜蓿响应干旱胁迫的表观遗传调控机制提供理论依据。

关键词: 蒺藜苜蓿, MtBMI1, 基因克隆, 抗旱性

Abstract:

Drought significantly impedes the normal growth， development， and reproduction of plants， and has emerged as a pivotal factor contributing to the decline in crop and forage yields. The BMI1 protein， a key component of the Polycomb Group （PcG） protein complex that mediates histone ubiquitination， is crucial for the epigenetic regulation of plant responses to abiotic stresses. This study reports the cloning of MtBMI1， which encodes a member of the PcG family， from Medicago truncatula. Our analyses showed that the MtBMI1 gene sequence spans 5386 base pairs and encodes a protein comprising 429 amino acids， featuring two functional domains： zf-C3HC4 and RAWUL. Phylogenetic analyses revealed close relationships between MtBMI1 and PvBMI1-1 of Phaseolus vulgaris and GmBMI1-1 of Glycine max. A subcellular localization analysis in tobacco epidermal cells confirmed the nuclear localization of the MtBMI1 protein. Moreover， GUS staining analyses revealed robust activity of the MtBMI1 promoter in the mature inflorescence， stigma， flower， stem， and pedicel of Arabidopsis. Functional analysis via overexpression in Arabidopsis demonstrated that the histone H2AK119ub content was significantly higher （P<0.05） in transgenic lines than in wild type. Under drought stress， transgenic lines exhibited pronounced water-loss phenotypes， with reduced root length， root fresh weight， and aboveground fresh weight （P<0.05）， and elevated levels of malondialdehyde （P<0.05）， compared with the wild type. These findings suggest that MtBMI1 exerts a negative regulatory effect on M. truncatula’s response to drought stress. The results of this study offer insights into the epigenetic mechanisms underlying drought stress tolerance in this model legume species.

Key words: Medicago truncatula, MtBMI1, gene cloning, drought resistance

赵媛媛, 蒲小剑, 徐成体, 王伟, 傅云洁. 蒺藜苜蓿MtBMI1基因克隆及抗旱性分析[J]. 草业学报, 2025, 34(6): 139-153.

Yuan-yuan ZHAO, Xiao-jian PU, Cheng-ti XU, Wei WANG, Yun-jie FU. Cloning of the MtBMI1 gene from Medicago truncatula and its role in drought tolerance[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2025, 34(6): 139-153.

图/表 19

表1 MtBMI1基因克隆、载体构建及qRT-PCR引物汇总

Table 1 Summary of primers used for MtBMI1 gene cloning， vector construction and qRT-PCR

引物Primer	引物序列Primer sequence （5'-3'）
Mt-Actin F	TACCCCATTGAGCACGGTAT
Mt-Actin R	ATACATGGCAGGCACATTGA
Mt-BMI1 F	AAGGATGGAAGCGTACCTGTCTCA
Mt-BMI1 R	TGAATCAGCCACAGCTCAACCAA
MtBMI1 F	ATGTCGAATGATGTTGTGAAAGTGA
MtBMI1 R	TCAAGGGCGTGGAGATTTCCG
MtBMI1 MF	TGACCATGGTATCGAATGATGTTGTGAAAGTGA
MtBMI1 MR	AGGGTGACCTCAAGGGCGTGGAGATTTCCG
pC3301-R	AGTAACATAGATGACACCGC
MtBMI1 promoter F	TGTATCGAGAGGTGTGTAATCAGTAC
MtBMI1 promoter R	CACTTTCACAACATCATTCGACAT
MtBMI1 promoter MF	TACCCGGGGATCCTCTAGAGTATCGAGAGGTGTGTAATC
MtBMI1 promoter MR	ACCCTCAGATCTACCATGGATATTCTTGATGATTTCTTGCT
MtBMI1 GFP F	TGGAGAGGACACGCTCGAGATGTCGAATGATGTTGTGAA
MtBMI1 GFP R	CCCTTGCTCACCATGAATTCAGGGCGTGGAGATTTCCG
Bar F	ATGAGCCCAGAACGACGCCC
Bar R	TCAAATCTCGGTGACGGGCA

图1 MtBMI1的基因特征

Fig.1 The characteristics of MtBMI1 gene

图2 MtBMI1的全长CDS序列及对应的氨基酸序列

Fig.2 The full length of CDS and corresponding amino acid sequence of MtBMI1

图3 MtBMI1蛋白的保守结构域、二级和三级结构A：蒺藜苜蓿MtBMI1蛋白的结构域分析；B：蒺藜苜蓿MtBMI1蛋白质二级结构预测；C：蒺藜苜蓿MtBMI1蛋白质三级结构预测。A： The conserved domain analysis of MtBMI1 protein in M. truncatula； B： Prediction of secondary structure of MtBMI1 protein in M. truncatula； C： Prediction of tertiary structure of MtBMI1 protein in M. truncatula.

Fig.3 Conserved domains， secondary and tertiary structures of MtBMI1 protein

图4 BMI1蛋白的多序列比对Gm：大豆 G. max； Pv：菜豆 P. vulgaris； At：拟南芥 A. thaliana；Os：水稻 O. sativa；Mt：蒺藜苜蓿 M. truncatula；下同The same below.

Fig.4 Multiple sequence alignment of BMI1 protein

图5 BMI1基因的系统进化树构建

Fig.5 Phylogenetic tree construction of BMI1 gene

图6 MtBMI1在蒺藜苜蓿不同发育时期和不同组织中的表达谱不同字母代表差异显著（P<0.05），下同。Different letters show significant difference （P<0.05）， the same below.

Fig.6 Expression profiles of MtBMI1 in different developmental stages and tissues of M. truncatula

图7 不同浓度甘露醇处理下MtBMI1的表达谱

Fig.7 Expression profiles of MtBMI1 under different concentrations of mannitol

图8 MtBMI1基因在烟草叶片中的亚细胞定位从左到右依次为绿色荧光蛋白、明场、叶绿体自发荧光、3个通道的叠加图。Pictures from left to right are the green fluorescent protein channel （UV）， bright field （DIC）， chlorophyll autofluorescence channel （CHI） and overlay of three channels （Merge）.

Fig.8 Subcellular localization of MtBMI1 gene in tobaccoleaf

图9 RT-PCR克隆MtBMI1启动子M表示marker，下同。M represents marker， the same below.

Fig.9 MtBMI1 promoter cloned by RT-PCR

图10 pCAMBIA3301-MtBMI1启动子转拟南芥GUS染色

Fig.10 GUS staining results of pCAMBIA3301-MtBMI1 promotertransgenic Arabidopsis

图11 RT-PCR克隆MtBMI1基因

Fig.11 MtBMI1 gene cloned by RT-PCR

图12 转基因拟南芥各株系MtBMI1表达水平

Fig.12 The relative expression levels of MtBMI1 in transgenic Arabidopsis lines

图13 苗期和抽薹期的转基因与野生型拟南芥表型比较

Fig.13 Phenotypic comparison of transgenic and wild-type Arabidopsis at seedling and bolting stages

图14 300 mmol·L-1甘露醇处理下转基因与野生型拟南芥表型比较

Fig.14 Phenotypic comparison of transgenic and wild-type Arabidopsis under 300 mmol·L-1 mannitol treatment

图15 甘露醇处理对转基因与野生型拟南芥丙二醛和脯氨酸的影响*表示各材料间差异显著（P<0.05）。* indicate the significant differences among materials （P<0.05）.

Fig.15 Effects of mannitol treatment on the content of malondialdehyde and proline in transgenic and wild-type Arabidopsis

图16 MtBMI1转基因拟南芥抗旱性评价*表示对照与处理间差异显著（P<0.05），不同字母表示材料间差异显著（P<0.05）。* mean significant difference between control and treatment （P<0.05）， different letters show significant difference among materials （P<0.05）.

Fig.16 Evaluation of drought resistance in MtBMI1 transgenic Arabidopsis

图17 MtBMI1转基因拟南芥H2AK119ub组蛋白含量分析

Fig.17 Analysis of H2AK119ub histone content in MtBMI1 transgenic Arabidopsis

图18 转基因拟南芥中与表观遗传修饰相关基因的表达水平

Fig.18 Expression levels of epigenetic modification related genes in transgenic Arabidopsis

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蒺藜苜蓿MtBMI1基因克隆及抗旱性分析

Cloning of the MtBMI1 gene from Medicago truncatula and its role in drought tolerance

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