紫花苜蓿低温诱导蛋白MsLTI65的分离及其对不同逆境的响应

doi:10.11686/cyxb2024247

摘要/Abstract

摘要：

LTI是植物中一类低温诱导蛋白，在植物响应非生物胁迫中发挥着重要的作用。为明确紫花苜蓿LTI蛋白的结构特征及在不同非生物胁迫下的响应，通过RT-PCR和3′/5′ RACE PCR技术，成功从“中苜1号”紫花苜蓿中克隆得到MsLTI65基因cDNA序列。利用生物信息学软件对基因序列和结构进行分析，并与其他植物的LTI蛋白进行系统进化树构建，分析它们之间的进化关系。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（western-blot，WB）技术分析MsLTI65在不同非生物胁迫条件下的表达模式。序列分析表明，MsLTI65基因编码区序列长2016 bp，编码671个氨基酸，分子量74 kDa，理论等电点为4.55，MsLTI65蛋白与蒺藜苜蓿的MtLTI65蛋白具有较高的同源性。qRT-PCR检测结果表明，MsLTI65基因在冷、盐、干旱、Cu²⁺、Zn²⁺和脱落酸（ABA）胁迫下表达量均受到诱导上调表达。抗体制备结果表明，已成功制备MsLTI65多克隆抗体，该多克隆抗体特异性高，能够识别天然LTI65样本。Western-blot验证结果表明，MsLTI65蛋白受冷、干旱、盐、ABA胁迫诱导表达。以上结果表明，MsLTI65基因可能作为一个正向调控因子在冷、干旱、Cu²⁺、Zn²⁺、盐等多种非生物胁迫信号和ABA激素信号转导过程中发挥重要作用。

关键词: 紫花苜蓿, MsLTI65, 基因克隆, 表达分析, 抗体, 非生物胁迫

Abstract:

Low temperature-inducible （LTI） proteins are a class of stress-responsive proteins in plants that play a crucial role in response to abiotic stress. To elucidate the structural characteristics of the MsLTI65 protein in alfalfa （Medicago sativa） and its response to various abiotic stresses， the cDNA sequence of the MsLTI65 gene was successfully cloned from alfalfa cultivar “Zhongmu No.1” using reverse-transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and 3′/5′ rapid-amplification of cDNA ends （RACE PCR） techniques. Bioinformatics tools were employed to analyze the gene sequence and structure， and a phylogenetic tree was constructed to explore the evolutionary relationships between MsLTI65 and LTI proteins from other plants. The expression pattern of MsLTI65 under different abiotic stress conditions was analyzed by quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blotting （WB）. Sequence analysis indicated that the MsLTI65 gene had a coding region sequence length of 2016 bp， encoding a polypeptide of 671 amino acids with a molecular weight of 74 kDa and a theoretical isoelectric point of 4.55. The MsLTI65 protein showed high homology with the MtLTI65 protein from Medicago truncatula. The qRT-PCR results showed that MsLTI65 expression was induced and upregulated under cold， salt， drought， Cu²⁺， Zn²⁺， and abscisic acid （ABA） stresses. The antibody preparation results indicated that a polyclonal antibody against MsLTI65 was successfully generated. This polyclonal antibody exhibited high specificity and was able to recognize native LTI65 samples. Western-blot validation demonstrated that MsLTI65 protein expression is induced by drought， salt， cold and ABA stresses. The results of this study suggest that MsLTI65 functions as a positive regulatory factor in the signal transduction of various abiotic stresses， including cold， drought， Cu²⁺， Zn²⁺， salt， and ABA hormone signaling.

Key words: Medicago sativa, MsLTI65, gene cloning, expression analysis, antibody, abiotic stresses

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图/表 12

表1 所用引物信息

Table 1 Primer information used in the experiment

引物名称Primer name	引物序列Primer sequence （5′→3′）	用途Function
MsLTI-3′-RACE	TGATGAGTCAAAACCTGCCACAGAACCA	基因克隆 Gene cloning
MsLTI-5′-RACE	CCAACAGCATCCTTAACCTTGTCAACCA
MsLTI65-F	ATGGATTCAAGAGTTGTTCATAGTC
MsLTI65-R	TTACTCCTGTTTTCCTCCTTCA
Actin-F	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT	内参基因 Reference genes
Actin-R	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG	内参基因 Reference genes
qlTI65-F	AGCTGATAAAGCTTCTAAGCTCGG	表达分析 Expression analysis
qlTI65-R	GTTTCAGTTCCGTCATTAGTTCCA	表达分析 Expression analysis
LTI65-F	TCAGGGATCCGTGCATGATGAGCCAAAACC	抗体制备 Antibody preparation
LTI65-R	CGTAGTCGACTTACTCCTGTTTTCCTCCTT	抗体制备 Antibody preparation

表2 所用生物信息学工具

Table 2 Bioinformatics tools used

生物信息学工具 Bioinformatics tools	网址 Website	用途 Purpose
Open Reading Frame Finder	https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/	开放阅读框分析Open reading frame analysis
SMART	https：//smart.embl.de/	蛋白质保守结构域分析Protein conserved domain analysis
Expasy-ProtParam tool	https：//web.expasy.org/protparam/	蛋白质理化性质分析Analysis of physical and chemical properties of proteins
PRABI	https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html	蛋白质二级结构分析Protein secondary structure analysis
AlphaFold	https：//alphafoldserver.com/	蛋白质三级结构分析Protein tertiary structure analysis
BLAST	https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi	同源蛋白序列分析Homologous protein sequence analysis
DNAMAN	https：//www.lynnon.com/qa.html	多序列比对Multiple sequence alignment
Plant CARE	https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/	顺式作用元件分析Cis-acting element analysis
MEGA	https：//www.megasoftware.net/	系统进化树构建Phylogenetic tree construction
NetPhos-3.1	https：//services.healthtech.dtu.dk/ services/NetPhos-3.1/	蛋白磷酸化位点分析Protein phosphorylation site analysis
SignaL.P-5.0	http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/	蛋白质信号肽分析Protein signal peptide analysis
TMHMM-2.0	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/	蛋白跨膜结构分析Protein transmembrane structure analysis

图1 MsLTI65基因的克隆M： DL2000 DNA分子量标准DL2000 marker； 1： 5′RACE产物5′RACE product； 2： 3′RACE产物3′RACE product； 3： ORF扩增产物ORF amplification product.

Fig.1 Cloning of MsLTI65 gene

图2 MsLTI65的cDNA全序列

Fig.2 Full cDNA sequence of MsLTI65

图3 紫花苜蓿MsLTI65蛋白理化性质分析A：亲疏水性及保守性分析Hydrophilicity and conservation analysis； B：磷酸化位点分析Phosphorylation site analysis； C：跨膜结构预测 Transmembrane structure prediction； D：信号肽预测Signal peptide prediction.

Fig.3 Analysis of physicochemical properties of alfalfa MsLTI65 protein

图4 MsLTI65蛋白的二级结构和三级结构预测A：MsLTI65蛋白的二级结构；红色为延伸链结构；紫色为无规则卷曲结构；绿色为β-折叠结构；蓝色为α-螺旋结构。The secondary structure of MsLTI65 protein； Red： Extended chain structure； Purple： Irregular coiled structure； Green： β-sheet structure； Blue： α-helix structure；B： MsLTI65蛋白的三级结构The tertiary structure of MsLTI65 protein.

Fig.4 Prediction of the secondary and tertiary structures of MsLTI65 protein

图5 MsLTI65与不同物种同类基因的蛋白序列系统进化树分析Ms：紫花苜蓿M. sativa； Mt：蒺藜苜蓿M. truncatula； Ca：鹰嘴豆C. arietinum； Gm：大豆G. max； Gs：野大豆G. soja； Va：赤豆Vigna angularis； At：拟南芥A. thaliana； Ps：豌豆P. sativum； Tp：红三叶T. pratense； Vu：豇豆Vigna unguiculata； Vr：绿豆Vigna radiata； Ss：密花豆Spatholobus suberectus； Mp：刺毛黧豆Mucuna pruriens； Ap：相思子Abrus precatorius； La：狭叶羽扇豆Lupinus angustifolius； Ah：落花生Arachis hypogaea； Ai：花生二倍体野生种Arachis ipaensis； Tr：白三叶T. repens； Os：水稻O. sativa； Cc：木豆C. cajan. 下同The same below.

Fig.5 Phylogenetic tree analysis of protein sequences of MsLTI65 and similar genes in different species

图6 紫花苜蓿MsLTI65蛋白保守基序分析

Fig.6 Analysis of conserved motifs in the MsLTI65 protein of alfalfa

表3 MsLTI65基因启动子部分顺式作用元件分析

Table 3 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of the MsLTI65 gene

元件名称Element name	序列Sequence	数量Amount	功能Function
TCT-motif	TCTTAC	1	光响应模块的一部分Part of a module for light response
MYC	CATTTG	5	MYC结合位点MYC binding site
Box 4	ATTAAT	1	光响应元件Light responsive element
Chs-CMA1a	TTACTTAA	1	光响应元件Light responsive element
GT1-motif	GGTTAA	1	光响应元件Light responsive element
LTR	CCGAAA	2	参与低温响应的顺式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness
ARE	AAACCA	4	无氧诱导调节元件Anaerobic induction regulating element
TC-rich repeats	GTTTTCTTAC	2	参与防御和胁迫反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
ABRE	CACGTG/ACGTG	4	参与脱落酸反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
DRE	GCCGAC	1	参与脱水反应的顺式作用元件Cis-acting elements involved in dehydration reactions

图7 MsLTI65在不同非生物胁迫处理下的相对表达量不同小写字母表示不同处理时间间差异显著（P<0.05）。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatment times （P<0.05）.

Fig.7 Relative expression levels of MsLTI65 under different abiotic stresses

图8 MsLTI65的多克隆抗体制备及Western-blot检测A：小量诱导表达MsLTI65融合蛋白检测；M：非预染蛋白Marker （0.1 mg·mL-1）；1：未进行IPTG处理的菌液（对照组）；2：IPTG处理的菌液（试验组）。A： Small amount of induced expression of MsLTI65 fusion protein detection； M： non-prestained protein Marker （0.1 mg·mL-1）； 1： Bacterial solution without IPTG treatment （control group）； 2： IPTG treated bacterial solution （experimental group）. B：大量诱导表达MsLTI65融合蛋白检测。1：转化pGEX-3X-MsLTI65的菌种沉淀；2：转化pGEX-3X-MsLTI65的菌种上清。B： Large amounts of induced expression of MsLTI65 fusion protein detection. 1： Transformed pGEX-3X-MsLTI65 strain precipitation； 2： Transformed of pGEX-3X-MsLTI65 strain supernatant. C：MsLTI65融合蛋白的纯化。1：纯化的MsLTI65融合蛋白。C： Purification of MsLTI65 fusion protein. 1： Purified MsLTI65 fusion protein. D：MsLTI65多克隆抗体的纯化。1：MsLTI65纯化抗体。D： Purification of MsLTI65 polyclonal antibody. 1： MsLTI65 purified antibody. E：抗血清中MsLTI65抗体效价检测。E： Titer detection of MsLTI65 antibody in antiserum. F：MsLTI65多克隆抗体Western-blot检测。Lane1：NaCl胁迫6 h的天然样本；Lane2：NaCl胁迫12 h的天然样本。F： Western-blot analysis of MsLTI65 polyclonal antibody. Lane1： Natural samples subjected to NaCl stress for 6 h； Lane2： Natural sample subjected to NaCl stress for 12 h.

Fig.8 Polyclonal antibody preparation and Western-blot detection of MsLTI65

图9 MsLTI65蛋白在不同非生物胁迫条件下的相对表达量CK： 0 h； M：蛋白质分子量标准Protein marker.

Fig.9 Relative expression of MsLTI65 protein under different abiotic stress conditions

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