紫花苜蓿MsBBX20基因克隆及耐盐功能分析

doi:10.11686/cyxb2023460

摘要/Abstract

摘要：

BBX家族转录因子参与光形态建成、成花生理、避荫反应、种子生长发育、激素信号转导及对逆境胁迫的响应等植物重要生长发育过程。紫花苜蓿是耐盐性较强的牧草饲料作物，其品质优良，有“牧草之王”的美誉。发掘并探索紫花苜蓿MsBBX20基因响应非生物胁迫的分子机理，有助于揭示紫花苜蓿抗逆生物学基础，为紫花苜蓿抗逆分子育种提供新的基因资源。通过RT-PCR、3′/5′RACE PCR技术克隆得到MsBBX20基因cDNA序列，生物信息学分析发现其CDS全长834 bp，编码278个氨基酸，该基因编码的蛋白质为锌指结构蛋白家族成员。利用qRT-PCR技术分析MsBBX20在紫花苜蓿不同组织和不同非生物胁迫下的表达模式。通过基因枪轰击技术，在洋葱表皮瞬时表达MsBBX20进行亚细胞定位。克隆得到大小为1737 bp的MsBBX20启动子序列并分析了顺式作用元件，该启动子可驱动GUS报告基因在烟草的叶、茎和根中高效表达。将MsBBX20启动子序列与包含GUS基因的pCAMBIA-1301载体连接，瞬时转化烟草并通过组织化学染色对不同组织进行GUS活性分析。构建pCAMBIA3301-MsBBX20植物超表达载体，通过农杆菌介导的方法遗传转化野生型拟南芥，获得超表达MsBBX20的拟南芥株系。用不同浓度盐溶液（150、200和300 mmol·L^-1 NaCl）处理拟南芥转基因株系并分析其MDA含量和抗氧化酶活性。进化分析表明紫花苜蓿MsBBX20蛋白与红三叶TpBBX20的亲缘关系最近。MsBBX20蛋白定位于细胞核。MsBBX20基因在花中表达量最高，且MsBBX20可以响应干旱、盐、冷、脱落酸、赤霉素、光照等多种非生物胁迫。遗传转化获得MsBBX20过表达拟南芥株系，并选择3个高表达阳性株系进行功能验证。在不同浓度NaCl处理条件下，过量表达MsBBX20的拟南芥株系的丙二醛（MDA）含量显著低于对照，而超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性均显著高于对照。克隆获得紫花苜蓿锌指蛋白转录因子基因MsBBX20，该基因在花中表达量最高，能够响应多种非生物逆境胁迫和外源激素处理，表明MsBBX20可能参与紫花苜蓿的多个逆境响应过程。进一步的研究证明MsBBX20可能通过调节植物的抗氧化酶系统，缓解逆境造成的植物细胞氧化损伤，提高转基因拟南芥对盐胁迫的抗性，进而增强植株的耐盐性。

关键词: 紫花苜蓿, MsBBX20, 基因克隆, 耐盐性, 功能分析

Abstract:

The BBX family of transcription factors is involved in plant growth and development processes such as photomorphogenesis， flowering physiology， shade avoidance， seed development， hormone signaling， and responses to environmental stress. Medicago sativa， commonly known as alfalfa， is a forage crop with strong salt tolerance and high forage quality， and has been called the “queen of forages”. Uncovering and investigating the molecular mechanisms of the alfalfa MsBBX20 gene in response to abiotic stress can reveal the biological basis for alfalfa stress resistance and provide new genetic resources for molecular breeding for stress resistance. The MsBBX20 gene cDNA sequence was cloned using RT-PCR and 3′/5′ RACE PCR techniques， and bioinformatics analysis showed that its CDS is 834 bp long， encoding 278 amino acids， and the protein is a member of the zinc finger protein family. The expression pattern of MsBBX20 in different alfalfa tissues and under various abiotic stresses was analyzed using qRT-PCR technique. Subcellular localization was performed by transiently expressing MsBBX20 in Allium cepa epidermis via a gene gun. The MsBBX20 promoter sequence， with a length of 1737 base pairs， was cloned and its cis-acting elements were analyzed. This promoter can efficiently drive the expression of the GUS reporter gene in the leaves， stems， and roots of Nicotiana tabacum. The MsBBX20 promoter sequence was linked to the pCAMBIA-1301 vector containing the GUS gene， and then transiently transformed into N. tabacum and GUS activity in different tissues was analyzed by histochemical staining. A pCAMBIA3301-MsBBX20 plant overexpression vector was constructed and genetically transformed into wild-type Arabidopsis thaliana using the Agrobacterium-mediated method， A. thaliana lines overexpressing MsBBX20 were thus obtained. Transgenic lines of A. thaliana were treated with different concentrations of salt solution （150， 200， and 300 mmol·L^-1 NaCl） and the malondialdehyde （MDA） content and antioxidant enzyme activity of different lines were analyzed. Evolutionary analysis indicated that the MsBBX20 protein of alfalfa is most closely related to the TpBBX20 of red clover （Trifolium pratense）. The MsBBX20 protein is localized to the nucleus. The MsBBX20 gene is most highly expressed in flowers and can respond to various abiotic stresses such as drought， salt， cold， abscisic acid， gibberellin， and light. Transgenic A. thaliana lines overexpressing MsBBX20 were obtained， and three highly expressed positive lines were selected for functional validation. Under different concentrations of NaCl， the MDA content of A. thaliana lines overexpressing MsBBX20 was significantly lower than the control， while the activities of superoxide dismutase， catalase， and peroxidase were significantly higher than the control. The MsBBX20 gene， a zinc finger protein transcription factor from alfalfa， is highly expressed in flowers and can respond to a variety of abiotic stresses and exogenous hormone treatments， indicating that MsBBX20 may be involved in multiple stress response processes in alfalfa. Further research demonstrated that MsBBX20 may enhance the resistance of transgenic A. thaliana to salt stress by regulating the plant’s antioxidant enzyme system， mitigating oxidative damage to plant cells caused by stress， and thereby improving plant salt tolerance.

Key words: Medicago sativa, MsBBX20, gene cloning, salt tolerance, function analysis

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图/表 14

表1 所用引物信息

Table 1 Primer information used in the experiment

引物名称Primer name	引物序列Primer sequence （5'→3′）	用途Function
BBX-3′-RACE	GGACCCAGATTCATCATCCACCA	基因克隆Gene cloning
BBX-5′-RACE	CAGAGCCAATACTGGTGGATGATGA
BBX-ORF-F	ATGAAGATCCAATGTGATGTGTGTG
BBX-ORF-R	TTATCGAAAGTGTCTAGATTTTTTTATG
BBX-Real-up	CCACCAGTATTGGCTCTGAACC
BBX-Real-low	CCTGTGTCACTAGCCATGTTGTCT
MsBBX20-SP1	AGGGTAGTCTTTGGAGTTGAGGTGA	启动子克隆Promoter cloning
MsBBX20-SP2	TTGTTGGCACGGTGGATGGTATGAT
MsBBX20-SP3	CCTCAGCTTTCTCACACACATCAC
BBX-1301-EcoRⅠ	TATGACCATGATTACGAATTCCGTACCTCACTAGTACCCAATTACA
BBX-1301-NcoⅠ	ACCCTCAGATCTACCATGGCCTCAGCTTTCTCACACACATCACA
BBX-PA7-GFP-Xho	TACTCGAGATGAAGATCCAATGTGATGTGT
BBX-PA7-GFP-SpeⅠ	GCACTAGTTCGAAAGTGTCTAGATTTTTTTA
BBX-3301-BglⅡ	TGACCATGGTAGATCTGATGAAGATCCAATGTGATGTGTGTG
BBX-3301-BstEⅡ	ATTCGAGCTGGTCACCTTATCGAAAGTGTCTAGATTTTTTTATG
35S-3301-F	AACAGAACTCGCCGTAAAGACT
MsActin2-F	CTCCAAGGGCTGTGTTTCCT	内参基因Reference genes
MsActin2-R	ATACCACGCTTGGACTGAGC
AtActin-F	GGACAAGTTATCACCATCGG
AtActin-R	ATTGGGCAGTTTCTTTGGTAGC

表2 所用生物信息学工具

Table 2 Bioinformatics tools used

生物信息学工具 Bioinformatics tools	网址 Website	用途 Purpose
Open reading frame finder	https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/	开放阅读框分析Open reading frame analysis
SMART	https：//smart.embl.de/	蛋白质保守结构域分析Protein conserved domain analysis
Expasy-ProtParam tool	https：//web.expasy.org/protparam/	蛋白质理化性质分析Analysis of physical and chemical properties of proteins
PRABI	https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html	蛋白质二级结构分析Protein secondary structure analysis
BLAST	https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi	同源蛋白序列分析Homologous protein sequence analysis
DNAMAN	https：//www.lynnon.com/qa.html	多序列比对Multiple sequence alignment
Plant CARE	https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/	顺式作用元件分析Cis-acting element analysis
MEGA	https：//www.megasoftware.net/	系统进化树构建Phylogenetic tree construction

图1 MsBBX20的克隆与cDNA全长及对应蛋白序列A：紫花苜蓿MsBBX20基因RACE-PCR结果；M： DL2000；1：3′-RACE 产物；2：5′-RACE 产物；3：ORF扩增产物。A：Results of RACE-PCR for MsBBX20 gene of M. sativa； M： DL2000 DNA marker； 1： 3′-RACE product； 2： 5′-RACE product； 3： ORF amplified product； B： MsBBX20的cDNA全序列 Full cDNA sequence of MsBBX20.

Fig.1 Cloning and full-length cDNA sequence of MsBBX20

图2 MsBBX20蛋白结构特征分析A： MsBBX20蛋白保守结构域 MsBBX20 protein conserved domain； B： MsBBX20蛋白的亲疏水性 The hydrophilicity of MsBBX20 protein； C： MsBBX20蛋白的二级结构；蓝色：α螺旋；绿色：β折叠；紫色：无规则卷曲；红色：延伸链。Secondary structure of MsBBX20 protein； Blue： Alpha helix； Green： Beta fold； Purple： Random curling； Red： Extended chain.

Fig.2 Structural characterization analysis of MsBBX20 protein

图3 MsBBX20编码氨基酸多序列比对Ms：紫花苜蓿；Mt：蒺藜苜蓿；Ca：鹰嘴豆；Gs：野大豆；Tp：红三叶；Va：赤豆；Gm：大豆；Ps：豌豆。下同。Ms： M. sativa； Mt： M. truncatula； Ca： C. arietinum； Gs： G. soja； Tp： T. pratense； Va： V. angularis； Gm： G. max； Ps： P. sativum. The same below.

Fig.3 Multiple sequence alignment of MsBBX20 encoded amino acids

图4 MsBBX20系统进化树分析At：拟南芥。At： A. thaliana.

Fig.4 Analysis of MsBBX20 phylogenetic tree

图5 MsBBX20-GFP在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析

Fig.5 Subcellular localization analysis of MsBBX20-GFP in onion epidermal cells

图6 MsBBX20基因启动子的克隆与表达分析A： MsBBX20基因启动子的克隆，M： DL2000；1：MsBBX20基因启动子长度。A： Cloning of the promoter of MsBBX20 gene， M： DL2000； 1： MsBBX20 gene promoter length. B： MsBBX20：GUS转基因烟草的GUS染色；图中比例尺为1 cm； CK为未转基因烟草组织，OE1~OE3为MsBBX20：GUS转基因烟草的不同组织。B： MsBBX20：GUS staining of transgenic tobacco； the scale in the figure is 1 cm； CK is an unmodified tobacco tissue， and OE1-OE3 are different tissues of MsBBX20：GUS transgenic tobacco.

Fig.6 Cloning and expression analysis of MsBBX20 gene promoter

表3 MsBBX20基因启动子部分顺式作用元件分析

Table 3 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of the MsBBX20 gene

元件名称 Element name	序列 Sequence	数量 Amount	功能 Function
AE-box	AGAAACTT/AGAAACAT/AGAAACAA	3	光响应模块的一部分Part of a module for light response
CATT-motif	GCATTC	2	光响应元件的一部分Part of a light responsive element
G-Box	CACGTT	2	参与光反应的顺式作用调节元件Cis-acting regulatory element involved in light responsiveness
ABRE	ACGTG	1	参与脱落酸响应的顺式作用元件Cis-acting elements involved in the abscisic acid response
HSE	CCGAAA	1	参与低温响应的顺式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness
MBS	CGGTCA	1	MYB结合位点MYB binding site
MRE	AACCTAA	1	光诱导的MYB响应元件MYB binding site involved in light responsiveness
Sp1	CC（G/A）CCC	1	光响应元件Light responsive element
TATC-box	TATCCCA	1	参与赤霉素反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness
TC-rich repeats	ATTCTCTAAC	1	参与防御和胁迫反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
Circadian	CAANNNNATC	2	参与昼夜节律顺行调控元件Cis-acting regulatory element involved in circadian control

图7 MsBBX20在紫花苜蓿各组织部位的表达量不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level.

Fig.7 Expression of MsBBX20 in various tissue parts of M. sativa

图8 MsBBX20在不同逆境胁迫处理下的相对表达量A：干旱胁迫（15% PEG6000）处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under drought stress （15% PEG6000） treatment； B：盐胁迫（250 mmol·L-1 NaCl）处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under salt stress （250 mmol·L-1 NaCl） treatment； C：赤霉素（10 mg·mL-1 GA）胁迫处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under gibberellin stress （10 mg·mL-1 GA） treatment； D：脱落酸（0.1 mmol·L-1 ABA）胁迫处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under abscisic acid stress （0.1 mmol·L-1 ABA） treatment； E：4 ℃冷胁迫处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under cold stress （4 ℃） treatment； F：持续光照处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under continuous light treatment； G：黑暗恢复光照处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under the treatment of dark recovery followed by light illumination； H：不同光周期处理下MsBBX20基因的相对表达量 The relative expression level of the MsBBX20 gene under different light periods treatment；横坐标L和D分别表示光照（Light）和黑暗（Dark） The horizontal coordinates L and D represent light and dark， respectively. 不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level.

Fig.8 Relative expression levels of MsBBX20 under different adverse stress conditions

图9 MsBBX20过表达转化拟南芥株系的分子检测与Southern-blot杂交分析A：转化拟南芥植株的PCR检测 M： DL2000；OE4、OE6和OE7：转基因拟南芥株系。A： PCR detection of transformed A. thaliana plants， M： DL2000； OE4， OE6 and OE7： transgenic Arabidopsis strains. B：转基因拟南芥的Southern杂交检测，CK+：阳性对照，CK-：阴性对照，B： Southern hybridization test of transgenic A. thaliana， CK+： Positive control， CK-： Negative control. C：转基因拟南芥MsBBX20基因的相对表达量。C： Relative expression of transgenic A. thalianaMsBBX20 gene. WT表示野生型拟南芥植株；不同小写字母表示差异达显著水平（P<0.05）。 WT indicates wild-type Arabidopsis plants； Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level.

Fig.9 Molecular detection and Southern-blot hybridization analysis of A. thaliana transgenic lines overexpressing MsBBX20

图10 NaCl胁迫下转MsBBX20基因拟南芥植株生长情况A：盐胁迫（150 mmol·L-1 NaCl）处理4 d的萌发情况 Germination after 4 days of salt stress （150 mmol·L-1 NaCl） treatment； B：盐胁迫（150 mmol·L-1 NaCl）处理7 d的侧根生长情况 Lateral root growth after 7 days of salt stress （150 mmol·L-1 NaCl） treatment； C：盐胁迫（200 mmol·L-1 NaCl）处理0~10 d的萌发情况 Germination after treatment with salt stress （200 mmol·L-1 NaCl） for 0-10 days； D：盐胁迫（200和300 mmol·L-1 NaCl）处理7 d的生长情况 Growth under salt stress （200 and 300 mmol·L-1 NaCl） for 7 days； E：盐胁迫（150 mmol·L-1 NaCl）处理7 d的侧根数量统计 Lateral root number statistics after 7 days of salt stress （150 mmol·L-1 NaCl） treatment； F：盐胁迫（200 mmol·L-1 NaCl）处理下植株鲜重 Plant fresh weight under salt stress （200 mmol·L-1 NaCl）； G：盐胁迫（300 mmol·L-1 NaCl）处理下植株叶绿素含量 Chlorophyll content of plants treated with salt stress （300 mmol·L-1 NaCl）； H：盐胁迫（300 mmol·L-1 NaCl）处理7 d后的植株存活率。Plant survival rate for 7 days after salt stress （300 mmol·L-1 NaCl）. 不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level.

Fig.10 Growth of transgenic Arabidopsis plants with MsBBX20 gene under NaCl stress

图11 盐胁迫下转MsBBX20基因的拟南芥植株生理指标变化情况A：不同NaCl浓度胁迫下转基因拟南芥和WT的POD活性测定 Determination of POD activity of transgenic A. thaliana and WT under different NaCl concentrations of stress； B：不同NaCl浓度胁迫下转基因拟南芥和WT的CAT活性测定 Determination of CAT activity of transgenic A. thaliana and WT under different NaCl concentrations of stress； C：不同NaCl浓度胁迫下转基因拟南芥和WT的SOD活性测定 Determination of SOD activity of transgenic A. thaliana and WT under different NaCl concentrations of stress； D：不同NaCl浓度胁迫下转基因拟南芥和WT的MDA含量测定。Determination of MDA content of transgenic A. thaliana and WT under different NaCl concentrations of stress. 不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。Different lowercase letters indicate significant differences at the P<0.05 level.

Fig.11 Changes of physiological indicators in A. thaliana plants transgenic for MsBBX20 under salt stress

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