雪莲SikCDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性分析

doi:10.11686/cyxb2022386

摘要/Abstract

摘要：

极端生境草本植物天山雪莲中的SikCDPK1基因可明显提高转基因烟草的低温、干旱耐受性。为探究SikCDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性，本研究利用实时荧光定量PCR技术检测了SikCDPK1基因在雪莲不同组织器官的表达水平以及对信号分子CaCl₂、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA₃）、水杨酸（SA）、H₂O₂的诱导响应模式，采用Kinase-Glo?技术检测了SIKCDPK1蛋白激酶活性，利用绿色荧光蛋白（GFP）基因融合蛋白表达法进行了SIKCDPK1蛋白的亚细胞定位。结果显示：SikCDPK1基因在雪莲根、茎、叶、种子、幼茎、幼叶中均表达，SikCDPK1基因受CaCl₂、ABA、GA₃、SA、H₂O₂的诱导表达但响应模式有差异；激酶活性分析发现Ca²⁺存在时，SIKCDPK1具有激酶催化活性，加入Ca²⁺螯合剂EGTA后，SIKCDPK1几乎没有激酶活性。SIKCDPK1激酶活性随Ca²⁺浓度增加而增加，Ca²⁺浓度（K_0.5）为48.7 nmol·L^-1时，SIKCDPK1激酶活性可达到最大活性的1/2；以HisⅢ为底物时，SIKCDPK1的K_m值可达到43.8 μg·mL^-1，SIKCDPK1蛋白定位于细胞核。上述结果表明SikCDPK1基因表达无明显组织特异性，可响应信号分子Ca²⁺、ABA、GA₃、SA、H₂O₂的诱导；SIKCDPK1发挥蛋白激酶活性需要Ca²⁺，SIKCDPK1主要在细胞核里发挥作用。

关键词: SikCDPK1基因, 表达, 蛋白激酶活性

Abstract:

The SikCDPK1 gene in the extreme habitat plant Saussurea involucrata can significantly improve the low temperature and drought tolerance of genetically modified tobacco. In order to further explore the expression characteristics and protein kinase activity of SikCDPK1 gene， real-time quantitative PCR was used to detect the expression level of SikCDPK1 gene in different tissues and organs of S. involucrata and the induced response mode of signal molecules CaCl₂， abscisic acid， gibberellin， salicylic acid and hydrogen peroxide， while Kinase-Glo? technology was used to detect the activity of SIKCDPK1 protein kinase， and the green fluorescent protein （GFP） fusion protein expression method was used to carry out the subcellular localization of SIKCDPK1 protein. The SikCDPK1 gene was found to be expressed in roots， stems， leaves， seeds， young stems and young leaves of S. involucrata and expression was induced by CaCl₂， abscisic acid， gibberellin， salicylic acid， hydrogen peroxide， but the response mode was different. Kinase activity analysis showed that SIKCDPK1 had kinase catalytic activity when Ca²⁺ was present， and SIKCDPK1 had almost no kinase activity after adding the Ca²⁺ chelating agent ethylene glycol tetraacetic acid. SIKCDPK1 kinase activity increased with increase in Ca²⁺concentration， and SIKCDPK1 kinase activity reached 1/2 of the maximum activity when Ca²⁺ concentration （K_0.5） was 48.7 nm. When HisⅢ was used as the substrate， the Km value of SIKCDPK1 reached 43.8 μg·mL^-1， and SIkCDPK1 protein was localized to the nucleus. In summary， the expression of the SikCDPK1 gene had no obvious tissue specificity， and could respond to the induction of signaling molecules Ca²⁺， abscisic acid， gibberellin， salicylic acid， hydrogen peroxide. Ca²⁺ is required for SIKCDPK1 to exert protein kinase activity， and SIKCDPK1 mainly functions in the nucleus.

Key words: SikCDPK1 gene, expression, protein kinase activity

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图/表 8

表1 引物

Table 1 The primers

引物Primer name	引物序列Primer sequence （5′→3′）	用途Purpose
GAPDH-F	TAGCAAGGATGCTCCCATGTTCGT	内参基因Internal genes primers
GAPDH-R	AAAGGAGCAAGGCAGTTGGTTGTC	内参基因Internal genes primers
SikCDPK1-qF	ATCCCAAACTGCCCTTGTCCTA	基因表达Gene expression analysis
SikCDPK1-qR	GAAGATACCCCACCTACCCCTAAC	基因表达Gene expression analysis
SikCDPK1-GFP-F	GGTACCATGGGGAATACTTGTGTTGGAC	亚细胞定位Subcellular localization
SikCDPK1-GFP-R	GTCGAC AAGTTTAAATGCTTCTCTGAACT	亚细胞定位Subcellular localization

图1 SikCDPK1基因组织特异性表达*： P<0.05； **： P<0.01. 下同The same below.

Fig.1 Tissue specific expression of SikCDPK1 gene

图2 SikCDPK1基因的表达特性

Fig.2 Expression characteristics of SikCDPK1

图3 SIKCDPK1重组蛋白纯化

Fig.3 Purification of SIKCDPK1 recombinant protein

图4 SIKCDPK1激酶活性

Fig.4 Kinase activity of SIKCDPK1

图5 Ca2+对SiKCDPK1活性的激发

Fig.5 Trigger action of SIKCDPK1 activity by Ca2+

图6 底物HisⅢ的Km值

Fig.6 The Km value of substrate HisⅢ

图7 SikCDPK1-GFP融合蛋白亚细胞定位

Fig.7 Subcellular localization of SikCDPK1-GFP fusion protein

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