Isolation of the low-temperature induced proteinMsLTI65 from alfalfa and its response to different stresses

doi:10.11686/cyxb2024247

Abstract

Abstract:

Low temperature-inducible （LTI） proteins are a class of stress-responsive proteins in plants that play a crucial role in response to abiotic stress. To elucidate the structural characteristics of the MsLTI65 protein in alfalfa （Medicago sativa） and its response to various abiotic stresses， the cDNA sequence of the MsLTI65 gene was successfully cloned from alfalfa cultivar “Zhongmu No.1” using reverse-transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and 3′/5′ rapid-amplification of cDNA ends （RACE PCR） techniques. Bioinformatics tools were employed to analyze the gene sequence and structure， and a phylogenetic tree was constructed to explore the evolutionary relationships between MsLTI65 and LTI proteins from other plants. The expression pattern of MsLTI65 under different abiotic stress conditions was analyzed by quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blotting （WB）. Sequence analysis indicated that the MsLTI65 gene had a coding region sequence length of 2016 bp， encoding a polypeptide of 671 amino acids with a molecular weight of 74 kDa and a theoretical isoelectric point of 4.55. The MsLTI65 protein showed high homology with the MtLTI65 protein from Medicago truncatula. The qRT-PCR results showed that MsLTI65 expression was induced and upregulated under cold， salt， drought， Cu²⁺， Zn²⁺， and abscisic acid （ABA） stresses. The antibody preparation results indicated that a polyclonal antibody against MsLTI65 was successfully generated. This polyclonal antibody exhibited high specificity and was able to recognize native LTI65 samples. Western-blot validation demonstrated that MsLTI65 protein expression is induced by drought， salt， cold and ABA stresses. The results of this study suggest that MsLTI65 functions as a positive regulatory factor in the signal transduction of various abiotic stresses， including cold， drought， Cu²⁺， Zn²⁺， salt， and ABA hormone signaling.

Key words: Medicago sativa, MsLTI65, gene cloning, expression analysis, antibody, abiotic stresses

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Figures/Tables 12

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引物名称Primer name	引物序列Primer sequence （5′→3′）	用途Function
MsLTI-3′-RACE	TGATGAGTCAAAACCTGCCACAGAACCA	基因克隆 Gene cloning
MsLTI-5′-RACE	CCAACAGCATCCTTAACCTTGTCAACCA
MsLTI65-F	ATGGATTCAAGAGTTGTTCATAGTC
MsLTI65-R	TTACTCCTGTTTTCCTCCTTCA
Actin-F	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT	内参基因 Reference genes
Actin-R	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG	内参基因 Reference genes
qlTI65-F	AGCTGATAAAGCTTCTAAGCTCGG	表达分析 Expression analysis
qlTI65-R	GTTTCAGTTCCGTCATTAGTTCCA	表达分析 Expression analysis
LTI65-F	TCAGGGATCCGTGCATGATGAGCCAAAACC	抗体制备 Antibody preparation
LTI65-R	CGTAGTCGACTTACTCCTGTTTTCCTCCTT	抗体制备 Antibody preparation

引物名称Primer name	引物序列Primer sequence （5′→3′）	用途Function
MsLTI-3′-RACE	TGATGAGTCAAAACCTGCCACAGAACCA	基因克隆 Gene cloning
MsLTI-5′-RACE	CCAACAGCATCCTTAACCTTGTCAACCA
MsLTI65-F	ATGGATTCAAGAGTTGTTCATAGTC
MsLTI65-R	TTACTCCTGTTTTCCTCCTTCA
Actin-F	CAAAAGATGGCAGATGCTGAGGAT	内参基因 Reference genes
Actin-R	CATGACACCAGTATGACGAGGTCG	内参基因 Reference genes
qlTI65-F	AGCTGATAAAGCTTCTAAGCTCGG	表达分析 Expression analysis
qlTI65-R	GTTTCAGTTCCGTCATTAGTTCCA	表达分析 Expression analysis
LTI65-F	TCAGGGATCCGTGCATGATGAGCCAAAACC	抗体制备 Antibody preparation
LTI65-R	CGTAGTCGACTTACTCCTGTTTTCCTCCTT	抗体制备 Antibody preparation

生物信息学工具 Bioinformatics tools	网址 Website	用途 Purpose
Open Reading Frame Finder	https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/	开放阅读框分析Open reading frame analysis
SMART	https：//smart.embl.de/	蛋白质保守结构域分析Protein conserved domain analysis
Expasy-ProtParam tool	https：//web.expasy.org/protparam/	蛋白质理化性质分析Analysis of physical and chemical properties of proteins
PRABI	https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html	蛋白质二级结构分析Protein secondary structure analysis
AlphaFold	https：//alphafoldserver.com/	蛋白质三级结构分析Protein tertiary structure analysis
BLAST	https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi	同源蛋白序列分析Homologous protein sequence analysis
DNAMAN	https：//www.lynnon.com/qa.html	多序列比对Multiple sequence alignment
Plant CARE	https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/	顺式作用元件分析Cis-acting element analysis
MEGA	https：//www.megasoftware.net/	系统进化树构建Phylogenetic tree construction
NetPhos-3.1	https：//services.healthtech.dtu.dk/ services/NetPhos-3.1/	蛋白磷酸化位点分析Protein phosphorylation site analysis
SignaL.P-5.0	http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/	蛋白质信号肽分析Protein signal peptide analysis
TMHMM-2.0	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/	蛋白跨膜结构分析Protein transmembrane structure analysis

生物信息学工具 Bioinformatics tools	网址 Website	用途 Purpose
Open Reading Frame Finder	https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/	开放阅读框分析Open reading frame analysis
SMART	https：//smart.embl.de/	蛋白质保守结构域分析Protein conserved domain analysis
Expasy-ProtParam tool	https：//web.expasy.org/protparam/	蛋白质理化性质分析Analysis of physical and chemical properties of proteins
PRABI	https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html	蛋白质二级结构分析Protein secondary structure analysis
AlphaFold	https：//alphafoldserver.com/	蛋白质三级结构分析Protein tertiary structure analysis
BLAST	https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi	同源蛋白序列分析Homologous protein sequence analysis
DNAMAN	https：//www.lynnon.com/qa.html	多序列比对Multiple sequence alignment
Plant CARE	https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/	顺式作用元件分析Cis-acting element analysis
MEGA	https：//www.megasoftware.net/	系统进化树构建Phylogenetic tree construction
NetPhos-3.1	https：//services.healthtech.dtu.dk/ services/NetPhos-3.1/	蛋白磷酸化位点分析Protein phosphorylation site analysis
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TMHMM-2.0	https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/	蛋白跨膜结构分析Protein transmembrane structure analysis

元件名称Element name	序列Sequence	数量Amount	功能Function
TCT-motif	TCTTAC	1	光响应模块的一部分Part of a module for light response
MYC	CATTTG	5	MYC结合位点MYC binding site
Box 4	ATTAAT	1	光响应元件Light responsive element
Chs-CMA1a	TTACTTAA	1	光响应元件Light responsive element
GT1-motif	GGTTAA	1	光响应元件Light responsive element
LTR	CCGAAA	2	参与低温响应的顺式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsiveness
ARE	AAACCA	4	无氧诱导调节元件Anaerobic induction regulating element
TC-rich repeats	GTTTTCTTAC	2	参与防御和胁迫反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
ABRE	CACGTG/ACGTG	4	参与脱落酸反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness
DRE	GCCGAC	1	参与脱水反应的顺式作用元件Cis-acting elements involved in dehydration reactions